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储存事项:AIPzol在室温下能稳定保存12个月。尽管如此,为达到最佳效果,我们建议保存在 2~8°C 的环境下,2~8°C能稳定保存24个月。
重要提示:本品中含有苯酚,具有毒性和腐蚀性。如果吸入体内、接触皮肤、吞食等会导致中毒、灼伤以及其他身体伤害。使用本制品时应穿戴防护物品,如防护服装、手套、眼罩、面罩等。如果不小心接触,应立即用大量的水冲洗并前往医院治疗。
产品介绍:AIPzol是传统TRIzol的免氯仿升级版,广泛适用于从各类动物组织、植物材料、培养细胞、细菌等样品中提取Total RNA和Small RNA。与传统TRIzol 提取方法相比,本产品不需要使用氯仿进行分层,操作更简单,且全程可在常温进行。本产品提取的 RNA基本不残留 DNA,提取的 RNA可以直接用于cDNA 克隆、qRT-PCR检测、mRNA纯化、体外翻译、Northernblotting 杂交、高通量测序等各种分子生物学实验。
注意事项:
1. 自备试剂:异丙醇(新开封或提取RNA专用)、75% 乙醇(用RNase-free Water 配制)、 RNase-free Water或者DEPC 处理过的水。
2. RNA 最重要的指标就是没有降解且完整性高,目前普通的分光光度计包括Nanodrop 是无法通过测量OD260/OD280和 OD260/OD230来确认RNA是否降解的。判断RNA是否降解,可以通过跑1%琼脂糖电泳检测,通过直接观察28S:18S 比值来判断是否降解,或者采用安捷伦Bioanalyzer 2100仪器检测,测定RNA产物的RIN值。
3. AIPzol与传统TRIzol一样属于通用型总RNA提取试剂,具有和TRIzol类似的适用范围。绝大部分常规动物组织细胞(如:肝脏、肾脏、脑组织、培养细胞)、简单植物组织(如水稻、玉米、拟南芥、烟草、小麦等)都有良好效果。但是对于多糖多酚植物如棉花,某些难破壁的细菌等样品不适用。
RNA抽提操作步骤(实验前请先阅读注意事项):
提示:用AIPzol抽提RNA时,请佩戴手套、口罩和护眼罩,避免接触皮肤和衣服,实验操作应在化学通风橱完成操作,避免呼吸道吸入。如无特殊说明,所有的操作应该在 15~30°C 的室温条件下进行。
1. 样本处理
a.植物组织:取新鲜植物组织在液氮中充分研磨,或将植物组织剪碎后直接在AIPzol中迅速研磨,每25 - 50 mg组织加入0.5mL AIPzol,混匀。
b.动物组织:取新鲜或-70℃冻存动物组织尽量剪碎,每15 - 50 mg组织加入0.5mL AIPzol,匀浆仪进行匀浆处理;或在液氮中研磨后加入0.5mL AIPzol,混匀。
c.单层培养细胞:尽量去除干净残留培养液后,直接往直径3.5 cm 的培养板中加入0.5mL AIPzol 覆盖并反复吹打裂解细胞。依据培养板的面积而不是依据细胞的数量来决定所需的AIPzol量(每10 cm2加0.5mL)。当AIPzol量不足时可导致抽提的RNA中有污的DNA。
▲注:贴壁培养细胞往往不能完全从培养瓶(皿)脱落,这并不意味着裂解不完全,此时细胞膜实际已经完全破裂开,并已释放出全部RNA,继续做即可。
d.细胞悬液:离心收集细胞。在AIPzol试剂中用移液管反复吹打来裂解细胞。每1 - 5×106的动物细胞,植物细胞或每5×106细菌加0.5mL AIPzol试剂。在加AIPzol试剂前应避免洗涤细胞,因为那样会增加mRNA降解的可能性。破裂某些细菌可能需要使用匀浆器。
e.液体样本:每200μL(低于200μL时,可用RNase-free Water补足)血浆、血清等液体样本,加入0.5mL AIPzol试剂后振荡、混匀 。
2. 向上述裂解液中加入2/5体积的 RNase-free Water(每500μL AIPzol试剂加200μL水),剧烈振荡、混匀,室温静置5 min。
▲注:当处理样本量较大50 mg左右时,可延长室温静置时间到10 - 15 min。
3. 室温12,000 rpm 离心15 min。
4. 离心后溶液分成上层水相(含RNA)和下层沉淀(含蛋白质、DNA、多糖等杂质),小心吸取上层水相至一个新的无酶离心管中。
▲注:上层水相约占总体积的90%,如用500μL AIPzol试剂进行提取,上层水相约为630μL,建议吸取500μL;提取微量样本时,为减少RNA损失,可以全部转移上清。
▲注:当样本量较小时,离心后可能不会出现下层沉淀,属于正常现象,可继续按后续步骤完成提取。
5. 加入等体积异丙醇,颠倒混匀,室温静置10 min。
6. 室温12,000 rpm 离心10 min,通常可以看见白色沉淀,小心弃去上清。
▲注:RNA沉淀在离心前通常不可见,离心后在管侧壁和管底形成薄片状沉淀(样品量少的情况下,RNA沉淀散在管侧壁和管底有可能看不到明显沉淀)。部分组织材料由于含有较多的代谢产物,导致沉淀不能聚集而分散在离心管壁上,此时,请沿液面缓慢吸取上清。
7. 加入1mL 75%乙醇(RNase-free ddH2O配制)漂洗,涡旋震荡15 sec,让沉淀悬浮起来,并上下颠倒数次。
8. 室温12,000 rpm 离心3 min,小心弃上清。
9. 重复步骤7和8漂洗一遍,小心弃尽上清。
▲注:为减少杂质残留,应尽可能的将上清弃干净。建议弃去大部分上清后,短暂点甩离心将残留液体甩至管底,用无酶的200μL吸头吸尽残留的液体,保留管底及管侧壁的白色RNA沉淀。
10. 室温晾干约1 min,在加入适量的RNase-free ddH2O溶解沉淀,室温涡旋3 min(或使用移液器反复吹打管底和管壁的沉淀帮助溶解),使RNA沉淀充分溶解。提取的RNA产物可以分装后在- 85至- 65°C长期保存,在- 30至- 15°C仅可短期保存。
▲注:一般稍稍晾干RNA即可,过度干燥会导致RNA难于溶解。
▲注:从某些样本提取RNA时,RNA沉淀并非完全聚集在离心管管底,也会以均匀的薄雾状沉淀吸附在管侧壁上,请注意仔细观察,并用移液器吹打管底和沉淀所在的管侧壁充分溶解所有的RNA。
品牌: | 爱普科学 |
别名: | AIPzol Total RNA Extraction Reagent(No Chloroform) |
规格说明: | 100mL |
性状: | 液体 |
储存温度: | 2-8℃ |
保质期: | 两年 |
产品说明: | 避光保存! |
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