储存条件：冰块运输，2-8℃保存，保质期2年。

产品说明：rProtein A/G Magnetic IP/Co-IP Kit是一款能够高效完成免疫沉淀(IP)及免疫共沉淀(Co-IP)实验的试剂盒。其包含高性能rProtein A/G MagPoly Beads，能够实现快速便捷的磁性分离。另外试剂盒内经过优化的缓冲液，为免疫沉淀实验提供了良好的反应条件，增强了免疫沉淀实验的稳定性。聚合物磁珠的配体是重组蛋白A/G(约14 kDa)，同时拥有蛋白A和蛋白G的IgG结合结构域，具有更广的抗体亚型结合范围。试剂盒的洗脱方式多样，既可以用低pH的洗脱液将免疫复合物从蛋白A/G磁珠上洗脱，也可以使用电泳上样缓冲液以变性条件洗脱免疫复合物，直接进行后续检测分析。本产品可广泛应用于细胞裂解物、细胞分泌上清、血清、腹水等样品中抗原的免疫沉淀反应。

操作步骤：

一、缓冲液的准备

1. 可使用试剂盒准备的缓冲液，也可根据实际情况配制不同的缓冲液体系。Lysis/Wash Buffer(5×)在使用前请稀释至并标记为1×Lysis/Wash Buffer，另根据需求，补加终浓度为0.1%-1% 的Lysis/Wash Buffer Enhanced，标记为1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)。所有缓冲液在使用前建议用0.22um或者0.45um滤膜过滤，稀释后的缓冲液建议4℃保存，若试剂浑浊，请立即丢弃。

2. 下列可能用到的试剂及材料未提供，需额外准备：

1) 电泳上样缓冲液,非还原性(5×)：0.3 M Tris-HCl(pH 6.8)，5% SDS，50% 甘油，0.5% 溴酚蓝

2) 二硫苏糖醇(DTT)

3) 蛋白酶抑制剂

4) 免疫沉淀所用抗原、抗体

二、样品准备

方案1：贴壁细胞的裂解

1)  小心去除单层细胞的培养基。

2)  用预冷PBS清洗细胞两次。

3)  根据下表的推荐体积向细胞中加入预冷的1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)。冰上孵育5 min，期间混匀几次。

4)  将上述裂解好的样品转移至一个新的离心管中，约13,000xg离心10 min，分离细胞碎片。

5)  将上清转移到一个新管中，进行蛋白浓度测定及后续实验，标记为细胞裂解样品。

注：针对各种标准培养皿的1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)的推荐使用体积。

方案2：悬浮培养细胞的裂解

1) 将细胞悬液以1,000xg离心5 min，收集细胞，弃上清。

2) 用预冷PBS将细胞团轻轻重悬，将细胞悬液以1,000xg离心5 min，收集细胞，弃上清。

3) 向细胞团块中加入预冷1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)。每50 mg细胞团块使用500uL。

4) 将上述裂解好的样品在冰上孵育5 min，期间混匀几次。13,000xg离心10 min，去除细胞碎片。

5) 将上清转移到一个新管中，备蛋白浓度测定及后续实验，标记为细胞裂解样品。

三、免疫沉淀：抗原、抗体与磁珠的结合顺序可根据实际情况调整，不同的孵育顺序对最终纯度及抗原产量均有影响，以下方案为推荐常用的实验方法。

1. 磁珠漂洗

1) 将rProtein A/G MagPoly Beads充分混匀，取20uL(0.2 mg)加入1.5mL离心管中。

2) 向磁珠中加入180uL 1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)，轻微涡旋混匀。

3) 将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸弃上清。

4) 向离心管中加入1mL 1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)，颠倒离心管数次或轻微涡旋混匀1 min，将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸弃上清。

2. 免疫沉淀

方案1：

1) 向上述准备好的磁珠(步骤2.3.1)中加入抗体，抗体推荐用量2-10ug，用抗体保存液或1×Lysis/Wash Buffer补充体积至500uL，室温混旋孵育30 min，将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸取上清，留样用于检测。

注：孵育温度和时间范围推荐为：室温 0.5h-2h 或者4℃ 1h-16h，根据实际的结合效果进行调整。

2) 向离心管中加入500uL 1×Lysis/Wash Buffer，颠倒离心管数次或轻微涡旋混匀1 min，将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸弃上清，重复至少两次。

3) 向离心管中加入500uL细胞裂解样品(步骤2.2)，每个免疫沉淀反应推荐的总蛋白量为500-1000ug，体积不足500uL可用1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)补足，室温混旋孵育30 min，将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸取上清，留样用于检测。

注：孵育温度和时间范围推荐为：室温 0.5h-2h 或者4℃ 1h-16h，根据实际的结合效果进行调整。

方案2：

1) 在离心管中，将细胞裂解样品(步骤2.2)与抗体混合孵育30 min。推荐抗体用量为2-10ug，每个免疫沉淀反应推荐的细胞裂解液总蛋白量为500-1000ug，体积不足建议用1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)将样品体积调整至500uL。

2) 将孵育后的样品加入准备好的磁珠(步骤2.3.1)中混旋孵育。

注：孵育温度和时间范围推荐为：室温 0.5h-2h 或者4℃ 1h-16h，根据实际的结合效果进行调整。

3) 将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸取上清，留样用于检测。

3. 磁珠漂洗

1) 向离心管中加入500uL 1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)，颠倒离心管数次或轻微涡旋混匀1 min，将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸弃上清，重复一次。

2) 向离心管中加入500uL 1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)，连同磁珠转移至一个新EP管中，颠倒离心管数次或轻微涡旋混匀1 min，将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸弃上清。

4. 洗脱

方案1(低pH洗脱)：向离心管中加入50uL Elution Buffer，室温混旋孵育10 min，将离心管置于磁分离器上，待磁珠全部吸附后，吸取上清为洗脱液，加入5-10uL Neutralization Buffer。

方案2(备选变性洗脱方法)：向离心管中加入50uL(1×)电泳上样缓冲液，将样品置于金属浴中，96-100℃加热10 min。通过磁分离器分离磁珠，保留含有目的抗原的上样缓冲液。

注：两种洗脱方案均包含捕获抗体及目的抗原，低pH洗脱样本中抗体为完整结构，变性洗脱样本中抗体解离为重链、轻链，请根据后续实验需求选择洗脱方案。

注意事项：

1. 在进行免疫沉淀操作之前，请务必认真阅读此说明书。除非另有说明，所有操作建议于4℃下进行。

2. 在保证洗杂效果的前提下，如果使用1×Lysis/Wash Buffer(Enhanced)洗杂，会造成抗体和介质，或者抗原和抗体之间结合效果降低，建议可以使用1×Lysis/Wash Buffer进行洗杂。

3. 如果需要在还原条件下洗脱，向1×电泳上样缓冲液中加入DTT(终浓度10-20 mM)。

4. 磁珠应保存在储存溶液中，防止干燥，使用前请充分混匀。

5. 经煮沸后的填料容易聚集并且失去抗体结合能力，经煮沸的填料不应再次使用。

6. 为保证最佳的实验结果，请选择特异性较强的抗体进行免疫沉淀反应。对于免疫沉淀实验，不同类型的抗体与抗原结合的亲和性是有区别的，有时抗体与抗原结合还会受到影响，因此，若本试剂盒提供的缓冲体系不能获得很好的实验结果，可自行优化缓冲液进行实验。

7. 实验设计时，建议加入对照组，以备后续实验结果分析使用。在确定实验结果前，建议保留各步骤抗原、抗体孵育后的样品以备验证。

8. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套和口罩操作。

9. 本产品仅限专业人士的科研使用，严禁用于临床诊断和药物等用途。

注意事项：

附表：

产品说明书.pdf