Q1：问大家一下，判断反转录出来的cDNA质量的好坏通过OD值判断是否准确？有没有懂的？

A1：

l 这种问题，我们已经反复都说过很多遍了，今天我们爱普科学来总结一下，省得一次次跟客户解释了，再此希望本篇文章能给客户讲解清楚，帮助客户后续遇到此类问题能做出合理的判断。开玩笑的说，cDNA去跑电泳检测的，或者测所谓cDNA浓度的，深深的暴露了自己基础知识的缺乏，需要去重新学习核酸生化这门课程了, 我们至少最基本的要知道RNA的组成，哈哈。

l 我这辈子以前不会，现在不会，将来也不会去跑一次cDNA电泳，或者测一次cDNA浓度来判断cDNA的好坏。判断cDNA的好坏或者反转录是否成功的唯一有效方法就是最后的PCR结果，如果通过普通PCR扩增结果，那就是来看谁扩增的更亮；如果通过荧光定量qPCR扩增结果，那就是看谁扩增起来的CT值早。目前全世界只有这两种方法来判断，如果还有其它的方法，欢迎来让我们开开眼界~

Q2：筛库需要对cDNA进行电泳，我不了解，但是cDNA跑电泳你是怎么判断好坏的？做三代测序，进行大小筛选或建酵母文库都需要进行cDNA电泳，大小筛选和cDNA好坏不是两码事么？

A2：

l 我的意思是你如何通过跑cDNA电泳来判断cDNA好坏，做大小筛选可以理解。我是反对，通过跑电泳来判断反转录是否成功或者好坏。你要筛选大小，通过电泳进行分离，这个当然好理解，不跑胶，没法分开。但是说通过跑电泳，来判断cDNA质量和好坏，就很搞笑了，或者我想知道怎么样的电泳图是代表反转录好的，怎么样的电泳图是代表反转录不好的。

l 我们看看RNA的组成，就很清楚为啥反转录效果没法通过跑电泳和测OD比值来知道。首先广义的总RNA，包括4种RNA：A.核蛋白体RNA（简称rRNA）这个就是我们常说的28S、 18S和5S， 这个占了总量的85%。 B.转运RNA(简称tRNA)。C.信使RNA(简称mRNA)。D.microRNA(简称miRNA)。从总量看，总量的85%是核蛋白体RNA， 而且大小就3种，所以能看见3条带。而mRNA只占RNA总量的1%-5%，而且还是几百种表达基因的总和，每一种基因可能连0.01%都看不见，所以没法看见条带，只能表现为28s和18s之间和上下的拖尾，涂抹带，背景荧光而已。那么我测量了总RNA去做反转录，真正能做反转录的mRNA只有1-5%， 85%是没用的28s、18s和5s，然后就算1:1 所有的mRNA都转录成cDNA，你看不见mRNA， 难道翻倍就能看见cDNA么？ 它最多是和mRNA一样，表现为背景荧光，这个背景荧光和mRNA本身的背景荧光是不是一样的？ 更要命的是，85%的核蛋白体RNA在转录过程中一般都会降解，降解后它会不会形成更多的涂抹带，背景荧光，你怎么分得清楚背景荧光是来源于mRNA还是cDNA，还是降解的核蛋白体RNA?

l 而且，大家知道核酸的增色效应，降解的RNA(85%的RNA)会完全覆盖掉cDNA的存在，它造成的吸光值的增色效应，会远远大于来源于cDNA的吸光值。就是这个道理，1%的cDNA在85%的降解的核蛋白体RNA的完全掩盖下，你怎么能通过跑电泳或者OD比值来发现它的好坏？所以，大家可以百度一下，通过跑电泳判断cDNA好坏的标准， 你百度得出来么？RNA电泳的好坏有明确标准就是 28s：18s比值， 你看看cDNA好坏的标准，网上能查出来么？反转录时间不同，降解的程度不同，cDNA真电泳了，那电泳图肯定是千奇百怪的，实际你看到的不是cDNA电泳图，你看到的是降解的核蛋白体RNA的电泳图。随着降解程度不同，表现不同而已。

l 你反转录完了之后，如果你里面只有cDNA那没问题，你测它的分光光度计测出来的OD值浓度，那就能换算成cDNA的浓度。但是现在是你反转录完了之后，里面主要的不是cDNA，主要的是你的降解的RNA、你的反转录酶、你的蛋白、你的杂质等等，这些东西它占了绝大部分，所以说你测出来的都是这些，就是你的背景都比它高很多倍，你怎么能测的出来里面的cDNA呢？它里面不是单纯的CDNA，它里面cDNA只占了1-2%，98-99%都是降解的这个RNA，还有DNTP，还有反转录酶，还有蛋白等等。也就是说不是不能测那个cDNA浓度，而是你测不出来这个cDNA浓度，你反转录完了之后，cDNA只占总吸光值里面的很少的一部分，所以你测出来的那个值高值低都没有用，而且因为那个RNA降解了，它的那个OD值反而会高，这叫核酸的增色效效应。所以这个概念本身就是错的，你测出来的浓度高不代表它真正的cDNA浓度高，你测出来的浓度低，也不代表它真正的cDNA浓度低，所以测这个是没有用，这种情况就是老师理解错误，概念混淆，但在实际中遇到了这种情况，大部分也是没有办法，作为市场竞争激烈的卖方来说，我们也不能说客户的理解错误，也就只能一遍一遍的不耐其烦的给这种客户讲清楚这个道理。我们希望借此文章来解答客户的理解错误和概念混淆。

l 下图为某客户跑的cDNA电泳图， 大家看看是不是和我说的一样，与其说这是一个cDNA电泳图，不如说是我刚才说的不同降解程度的核蛋白体RNA电泳图，这样的所谓cDNA你去测OD值，你觉得测出来的是cDNA么？ 还是那没有降解完全依旧可见的85%的核蛋白体RNA？

l 百度搜索“如何检测cDNA”截图：