l 确认RNA的质量好坏，必须跑电泳。只有结合RNA电泳+OD值和OD比值才能判断。如果不跑电泳，只测OD值和OD比值是无法100%确定RNA的质量好坏的。因为，机器测OD吸光值测的不仅仅是来源于RNA的吸光值，也包括残留杂质、残留蛋白、残留DNA的吸光值，甚至降解的RNA还会导致OD值升高(这叫核酸的增色效应)。这些吸光值都会导致OD值的虚高，造成误认为RNA浓度高，其实却是残留了杂质、蛋白、DNA或者降解的RNA。实际操作中经常会遇到已经完全降解的RNA，OD值和OD比值却基本正常，还显示浓度高（实际是降解的RNA因为核酸增色效应导致吸光值升高，从而造成浓度的虚高），不跑电泳，完全没法知道这个RNA已经降解完全不能用了。核酸纯化行业里面最大的问题，也是毒瘤般的误解就是：分光光度计厂家和Nanodrop的厂家，为了推销他们的机器就推广了一个错误的概念，就是机器可以测量核酸的纯度和浓度，你就不用跑电泳了，这绝对是最大的谎言和最大的误解。

l 跑电泳其实非常简单。核酸纯化，尤其是提取RNA，如果不跑电泳，仅仅测OD值和OD比值是无法100%确定RNA的质量好坏和无法判断RNA是否降解的，是否残留DNA和是否残留杂质也是无法判断的，很多蛋白（吸收峰280nm）以外的杂质的吸收峰都不在280nm或者230nm，因此单纯只测OD值和OD比值无法判断整体的纯度。而RNA是否降解，是否残留DNA，用机器测OD值就更无法判断了。所以电泳是必须要跑的，然后结合OD值和OD比值才能准确判断RNA质量。有的用户觉得跑RNA电泳很难很麻烦，但是再难再麻烦也需要跑电泳才能准确判断RNA是否良好，这是做好实验的前提。

l 举例说明：TRIzol提取玉米胚乳RNA，提取的RNA含有大量杂质的RNA，并且有部分降解的RNA，OD值和OD比值却和正常试剂盒提取的RNA基本相同，但是跑电泳发现实际浓度亮度不到正常试剂盒提取的RNA的一半，说明测量吸光值的一半以上来源于杂质的吸光值，或者降解的小片段RNA的吸光值。做下游荧光定量检测时，TRIzol提取的玉米胚乳RNA含有大量杂质和降解RNA，CT值比正常试剂盒提取的RNA晚了4-6个CT值。因此不跑电泳的话，只是根据他们的OD值和OD比值基本一致来判断，根本无法完全确认RNA的质量好坏。

提取RNA常见误解1：

误认为RNA提取一定要4℃离心。离心柱提取，上离心柱也用4℃离心，其实这是完全错误的，因为对于提取RNA来说，即使夏天在室温离心也没问题，完全不会降解，因为4℃离心容易导致裂解液里面的盐离子结晶沉淀，或者裂解液里面的SDS一类的沉淀，堵塞膜上的微小孔造成膜离心不干净，影响RNA纯度，所以说4℃离心对于RNA提取只有坏处，没有好处。那为什么有的公司要求4℃离心呢？一是因为有的公司的试剂盒抑制RNase不充分，担心温度高降解。二是有的公司技术人员不懂RNA提取的历史，最早RNA提取是用苯酚氯仿抽提的，没有离心柱，所以低温4℃有好处。那么教科书就写4℃，但是随着时代技术的更新已经发展到了离心柱型，他们却不懂道理，还以为必须4℃离心比较好，僵硬照搬书本，又不愿意花时间测试，还依然以为4℃低温肯定只有好处没有坏处，其实在现今技术更新迭代的离心柱型上反而是错误的。

提取RNA常见误解2：

误认为提取RNA/DNA不用跑电泳，只要测OD值和OD比值就可以知道浓度和纯度。核酸纯化方面，大家最大的误解，就是以为测了OD值就是测浓度，其实这个概念大错特错。测OD值，只是测吸光值，它不能等同于核酸浓度。吸光值可以来源于真正的核酸，也可以来源于残留的杂质、残留的蛋白、残留的降解的RNA/DNA，它们都有吸光值，所以测量的吸光值OD值高，不代表这都是纯核酸的浓度。核酸吸光值浓度也可能是来源于残留的杂质、降解的RNA/DNA、残留的蛋白等，这不是真正的纯核酸的浓度。只有在你提供的核酸(RNA/DNA)是100%纯的时候，测量的OD值浓度才是真正核酸浓度。

举个例子，我给你一个完全降解的RNA，你去测量它的OD值，它的OD值也会很高，机器把OD值换算成的浓度也就很高，但是这个你能用吗？你跑电泳一看啥也没有，RNA已经完全降解了。再举个例子，你提取DNA完全失败了(完全没提取到DNA)，但是里面残留了一堆的蛋白杂质和降解的RNA片段，你去测量它的OD值，也会非常的高，机器换算成浓度也非常高，但是你能说你成功提取了DNA吗？ 你跑电泳一看，啥DNA条带也没有，只有前面残留一堆的降解的RNA片段。这个就是RNA完全降解了，测OD值和OD比值，浓度都很好，但是跑电泳，你就看到全部降解了，RNA根本没有条带，全部降解了，完全不能用了。所以，只看OD值和OD比值来判断浓度是不可靠的。

提取RNA常见误解3：

误认为纯的RNA的OD260/OD280比值是1.8-2.1，或者误认纯的RNA比值是1.8-2.1， 超过2.0或者2.1就降解了，这是100%的完全误解，纯的RNA的OD260/OD280比值是2.2，比值2.1-2.2不但不一定是降解，反而可能是纯度高的标志，只有比值超过2.3才提示降解(是否真正降解必须通过电泳来确定，或者通过机器模拟电泳图来确认)。

提取RNA常见误解4：

误认为RNA的OD260/OD230比值偏低甚至很低，就认为RNA质量不行，无法用于下游实验，这个是一个非常流行的误解，也是危害最大的误解。真相是OD260/OD230比值偏低，大部分是因为提取RNA试剂用到的异硫氰酸胍的残留导致了OD230吸光值升高从而导致OD260/OD230比值偏低，但是这种残留的微量异硫氰酸胍在绝大部分情况下完全不影响下游的反转录、荧光定量、测序建库等实验。实验证明，即使残留0.1mM的异硫氰酸胍，也足够被分光光度计检测出来(导致OD260/OD230测量比值大幅度降低）。但是即使残留100mM 异硫氰酸胍(比机器能测量出来的浓度高1000倍的残留)，也不会抑制下游的反转录荧光定量PCR实验。而实践中，残留异硫氰酸胍达到100mM的情况基本不可能，即使真出现了这种极端高的残留，也不影响下游反转录荧光定量PCR实验。所以OD260/OD230比值低，根本不能用于判断RNA的质量好坏，不能用来判断是否可以用于下游相关实验。打个通俗的比方，一切的致癌物，脱离剂量去谈致癌性都是耍流氓。乙醇是世界卫生组织广而告之的标准的I类致癌物， 同样的甲醛也是I类致癌物，所有啤酒里面都有甲醛，但是你照样会喝酒和喝啤酒。因为你知道，极少微量的乙醇或者微量的甲醛并不致癌。问题就在这里，RNA提取常用到的异硫氰酸胍往往都会在提取的RNA里面有微量残留，因为分光光度计极其灵敏，非常低的残留就能导致OD260/OD230比值偏低，从而被机器检测出来。但是这个极其微量的残留，完全不影响RNA用于下游的反转录荧光定量PCR实验，不影响用于下游的测序建库等。以前对于RNA提取相关问题不清楚不能怪你，但是看到本篇文章对于RNA提取的详细解答再不能帮您解开心结，我就完全不知道该说些什么了~