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GenFectin 基因转染试剂(可做250次6孔板或35mm平皿转染)

货号：C102-01

品牌：爱普科学

货期：现货

价格：￥920

规格：

1mL 0.5mL

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产品问答

储存条件：GenFectin (1.0mg/ml) 在室温下运输，试剂到时请即存放于4℃，在4℃可存放一年以上。使用前请涡旋振荡混匀。

适用范围及特点：

1. 适应于众多原代培养细胞和转化细胞株的基因转染。

2. 适用于瞬时转染和稳定转染。

3. 适应于贴壁细胞和悬浮细胞转染。

4. 转染效率高且稳定，在有无血清存在的细胞培养基中均能获得高效率转染。

5. 细胞毒性低。

6. 转染程序简单，转染实验可以在半小时内完成。

产品介绍：

基因转染需要一定的转染试剂将带有目的基因的载体运送到细胞内。目前，最常用的转染试剂是阳离子脂质体和阳离子聚合物，它们的特点和病毒类似，容易透过细胞膜。其中，阳离子脂质体在体外基因转染中有很高的效率，然而在体内，它迅速被血清清除，在肺组织内累积，诱发强烈的抗炎反应，这将导致高水平的毒性，因此，在很大程度上限制了其应用。由于阳离子脂质体的局限性，阳离子聚合物转染试剂日益受到重视。

本试剂采用专利配方的阳离子聚合物为主要成分，可以与DNA形成稳定的复合物，保护DNA免受核酸酶的降解,在增加核酸稳定性的同时, 提高转染试剂/DNA复合体穿越细胞膜的效率，这种独特设计，显著提高了基因转染效率。此类试剂是目前非病毒介导方法中效率最高的转染试剂（不同种类细胞的转染效率可有明显差异）。此外GenFectin不被血清清除，血清和抗生素不影响其转染效果，转染试剂/DNA复合物可以直接加入完全细胞培养基中。GenFectin的细胞毒性很小，在适宜的条件下，根据推荐用量使用GenFectin进行转染实验，细胞存活率高于90%.每一批产品出厂前都要对其转染效率和毒性经过严格质控。

GenFectin 基因转染试剂(可做250次6孔板或35mm平皿转染)(图1)

操作方法：

ð 所需其它试剂： 使用者需准备150 mM NaCl(超纯水配制，高压或过滤灭菌)或注射用生理盐水作为GenFectin及DNA的稀释液，和要转染的DNA溶液(高纯度，浓度0.1~2μg/μl)。

1. 细胞接种：

1) 为了获得最好的转染效率，细胞密度应该40-80%，这因细胞株的不同而变化，对最常用的细胞株建议细胞密度50-60%。最理想条件是在转染前18-24小时，接种适量细胞置37℃，5% CO2 培养。(推荐接种细胞数量见附表)

2) 转染前一个小时可以考虑更换一次新鲜的培养液，体积可参考附表。

然而，对细胞毒性不敏感的细胞株可在细胞贴壁后(接种几小时后)即进行转染或者在细胞接种后立即进行转染也可以得到相近的结果。

2. 配制转染工作液：(6孔板或35 mm平皿，2 ml培养液)

3) 取5~8μg DNA(起始用量5μg)，加入稀释液中至总体积为100μl，轻轻混匀，室温放置。

4) 先将GenFectin涡旋振荡混匀。取GenFectin 1~4μl(起始用量2μl)，加入稀释液中至总体积为100μl，轻轻混匀，室温放置5分钟。

5) 将稀释的GenFectin逐滴加入稀释的DNA溶液中，轻轻混匀，所得的转染工作液在室温放置15分钟。

6) 将转染工作液轻轻混匀，逐滴加入2 ml培养液中，轻轻混匀培养液，置37℃，5% CO2 培养。

3. 细胞后续处理：

7) 24~48小时后，观察或收取细胞。

8) 稳定转染时，于转染后24~48小时消化细胞分至3~5个培养皿中，加适当浓度的相应抗生素(如G418)筛选。

注意事项：

1. 少量使用GenFectin时，可取精确量的GenFectin用无菌超纯水稀释一定倍数，以便精确取样量。该稀释液可在4℃保存1月左右。

2. 细胞的生长状态是转染效率的一个主要决定因素。在实验条件许可的情况下，使用高质量的培养液、优质血清等，可能会明显提高转染效率。

3. GenFectin在转染中不受血清影响，所以GenFectin / DNA复合物能直接加到含血清的培养基中，但稀释GenFectin和DNA的缓冲液不能混有血清，因为GenFectin在制备GenFectin / DNA复合物之前可能会与血清中的蛋白质反应，影响转染效率。

4. 如果细胞株很敏感，孵育2-4小时后除去转染复合物并加入含血清的新鲜培养基。

建议的起始转染条件：

培养容器	转染前一天接种细胞数	转染时培养液体积	DNA用量与稀释后体积		GenFectin量与稀释后体积
96孔板	1-1.5´10⁴个	0.1 ml	0.25 μg	5 μl	0.1 μl	5 μl
24孔板	0.5-1 ´10⁵个	0.5 ml	1.25 μg	25 μl	0.5 μl	25 μl
6孔板	2-4 ´10⁵个	2 ml	5 μg	100 μl	2 μl	100 μl
35mm培养皿	2-4 ´10⁵个	2 ml	5 μg	100 μl	2 μl	100 μl
60mm培养皿	4-6 ´10⁵个	4 ml	10 μg	200 μl	4 μl	200 μl

转染过程的优化：影响转染效率的因素有很多，细胞本身的特性和状态、转染试剂的用量、转染的DNA用量、转染试剂/DNA复合物比例、形成的复合物的形态大小、细胞数/细胞密度、细胞和转染复合物接触孵育的时间等等都可能影响转染效果，应该在具体实践中优化来确定最佳转染条件。优化后，对于同一细胞株，以后按照同样条件进行。

问题与解决方法：

问题

评论与建议

转染效率低

1. 质粒浓度太低-建议：使用最适宜的质粒数量。

2. 质粒纯度太低-建议：使用高质量的质粒(OD260/280>1.8)。

3. 细胞生长状态欠佳-建议：保证细胞密度和形态是最佳的。

4. 进一步减少转染时培养液体积(转染后6~16小时再补加足量培养液)。

5. 从起始用量开始，调整配制转染液中DNA和Genfectin的用量(保持转染工作液总体积不变)，以确定不同细胞的最佳转染条件。一般固定DNA用量(5μg)，与系列含量的Genfectin混合，选取Genfectin的最佳用量；也可固定Genfectin用量(2μl)，与系列含量的DNA混合，选取DNA的最佳用量；还可以固定GenFectin/DNA比率增加或，者减少质粒的用量。

6. 设立阳性对照，例如GFP Gene和luciferase Gene-建议：以便检查转结果。

细胞毒性太大

1. 接种前，细胞的健康状况直接影响细胞毒性。

2. 转染时细胞密度不能过低。

3. 增加转染时培养液体积，或保持GenFectin/DNA比率的同时减少质粒的用量。

4. 对某些敏感的细胞株，转染后3~4小时去除含转染复合物的培养液，更换为新鲜的完全培养液。

5. 确定基因产物是否有毒性。

6. 确认质粒没有内毒素。