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AipBest 选择性凋亡DNA Ladder抽提试剂盒(溶液型)

货号:AD202-01

品牌:爱普科学

货期:现货

价格:650

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产品储存:按试剂盒各组分保存,保质期一年。

储存事项:为保持活性方便运输,Enzyme A和Enzyme B为酶溶液,应该避免反复冻融降低活性,如果要分多次使用,最好按照每次使用量分装后-20℃保存。

产品介绍:凋亡(Apoptosis)或程序性死亡的细胞一个形态学的显著特点是染色体DNA以核小体为单位(185 bp)规律断裂形成长度约为n×185bp (n=1,2,3,4…)的DNA片段,经琼脂糖凝胶电泳显示为阶梯状凋亡DNA Ladder,是凋亡细胞最直观的特征。本试剂盒选择性从组织和细胞中分离提取凋亡DNA Ladder,通过选择性分离基因组DNA与凋亡DNA Ladder,最大限度的减少了基因组DNA对凋亡DNA Ladder的观察干扰,因此显著的提高了检测敏感度,反应可在微量离心管进行,2.5小时完成,快速方便;无需有机抽提,检测灵敏度极高,可从约2000个凋亡细胞中检测到DNA Ladder。推荐起始细胞量为5~10×105个,但投入的细胞量可在1×105 ~5×106之间变化。原则是总细胞中应含有至少约1~2×104个凋亡细胞。多于2×104个凋亡细胞通常可获得十分清晰的凋亡DNA Ladder。本试剂盒也可用于从组织中提取凋亡DNA Ladder。但与培养细胞相比,整体动物组织凋亡细胞出现的时间、部位、程度等规律性差往往造成难以准确取材,可能显著影响实验结果。但只要组织确实发生凋亡,有经验的用户也可以使用本试剂盒从组织提取凋亡DNA Ladder(参见说明4)。

产品说明:

1. 溴化乙锭染色过度将降低DNA条带检测灵敏度,可用水冲洗凝胶10~30分钟。如冲洗过头可再用溴化乙锭复染。可用更灵敏的DNA染色剂SYBR Green。也可进行丙烯酰胺DNA凝胶电泳和DNA银染。

2. 对细胞进行干预处理后,凋亡可能仅在某一时间点或某一干预强度下最为明显。需要进行预试验确定最佳干预时间或强度。此时也可用凋亡小体/hoeschst染色试剂盒(AD203)快速染色凋亡小体观察。

3. 推荐起始细胞量为5~10×105个,但投入的细胞量可在1×105 ~ 5×106之间变化。原则是总细胞中应含有至少约1~2×104个凋亡细胞。多于2×104个凋亡细胞通常可获得十分清晰的凋亡DNA Ladder。六孔板的一个孔相当于一个35mm培养皿长满后可得到1~10×105 个细胞,如果细胞凋亡发生率为10%,经过处理可得到约1~10×104个凋亡细胞,应该足以获得清晰的凋亡DNA Ladder。反之如果不能从>3×106个细胞获得清晰的凋亡DNA Ladder,表明其中凋亡细胞少于1%。此时增加细胞用量也难已奏效。

4. 从组织块提取凋亡DNA Ladder。取10~20mg组织块放入小玻璃匀浆器,加100~200μL的Extraction Buffer,上下手动匀浆15~20次。取出匀浆液,冰上5~10 min。振荡10秒。4500rpm 10分钟收集上清液并转移到新1.5mL离心管,执行提取步骤3。另外一种方法是将30~50mg组织剪碎后在PBS里面匀浆,制成细胞悬液,离心收集细胞后接步骤2继续执行提取。

5. 采用高质量琼脂糖,使用宽度较小和厚度较窄的样品梳子,制作较薄的琼脂糖凝胶(厚度约2~4mm);用较低的电压进行慢速电泳,将显著增加凋亡DNA条带检测灵敏度。电泳距离不要太长,否则将使小的凋亡DNA条带弥散而降低分辨率。

操作步骤:

1. 用PBS漂洗细胞两遍后微型离心机500×g、4ºC、5 min收集5~10×105个细胞(最好同时做一个未凋亡细胞的对照)。小心用移液枪吸弃上清,除尽管壁附着液体。

2. 将离心管底部的细胞沉淀用手指轻轻弹松打散后,加入100µL的Extraction Buffer,用振荡器激烈混合10秒钟后,1,100~1,600xg (约3500~4500rpm)离心5分钟。

3. 勿触动管底沉淀,将上清液转移到新的1.5mL离心管。

4. 沉淀按操作2.方法再重复一次。

5. 把上清液与操作3.的上清液合并于一起共约200µL,作为粗提取液(含有凋亡DNA片段,未凋亡染色体DNA已经通过沉淀去除)。

6. 向粗提取液中加入10% SDS溶液20µL后,再加入20µL的Enzyme A,混匀,56℃温育1小时。

7. 向上述混合液中加入20µL的Enzyme B,混匀,37℃温育1小时,或者直到变得透亮(可过夜)。

8. 向上述混合液中加入130µL的Precipitant后,颠倒混匀,再加入1mL的乙醇,混匀后—20℃放置1小时以上(沉淀凋亡DNA片段)。

9. 至少13,000rpm、4ºC离心15min,弃上清,加1mL的70%乙醇漂洗一遍后离心,倒去乙醇,并且尽量吸除管壁附着液体。敞开管口,室温晾干沉淀。

10. 用17µL的双蒸水或TE Buffer充分溶解沉淀,加3µL的6x DNA凝胶上样缓冲液震荡混匀。取全部20µL上样或者适量上样进行1% Agarose Gels电泳。溴化乙锭染色,紫外观察照相(凋亡发生率较低时,添加过量TE Buffer溶解沉淀有可能会导致浓度太稀,无法检出DNA Ladder,因此可减少用量,反之,可增加)。

品牌: 爱普科学
产品别名: AipBest Selective Apoptosis DNA Ladder Extraction Kit(Solution Type)
规格: 25T/50T
性状: 液体
储存温度: RT
保质期: 12个月
产品说明: 收到产品后,请尽快按照试剂盒内各组分的储存温度保存!
地址:北京市昌平区北清路1号珠江摩尔国际大厦5号楼2单元305
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