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AipBest 酵母基因组DNA快速提取试剂盒(离心柱型)

货号:YD201-01

品牌:爱普科学

货期:现货

价格:620

50T
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适用范围:适用于快速提取各种酵母基因组DNA

产品储存:本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

储存事项:

1. 结合液CB或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀,可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解,恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。

2. 蛋白酶K保存在即用型甘油缓冲液中,常温运输。收到后,不超过25℃室温至少保存6个月,4℃保存12个月,-20℃保存2年。

3. Lytic Enzyme为蜗牛酶甘油储液,因此比较粘稠,请小心取用,-20℃保存。蜗牛酶是从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的混合酶,它含有纤维素酶,果胶酶,淀粉酶,蛋白酶等20多种酶。适合破碎溶解各种酵母的细胞壁。

4. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。

产品介绍:该试剂盒采用DNA吸附柱和独有的溶液系统,适合于从多种来源的酵母培养物中快速简单地提取基因组DNA。约3mL处于指数生长期的酵母培养液一般一次抽提可纯化出10-15μg的高质量的基因组DNA。纯化DNA产物可直接用于PCR、酶切和杂交等实验。酵母细胞经Lytic Enzyme处理去除细胞壁后,独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶,然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物,蛋白等杂质去除,最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。

产品特点:

1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜,柱与柱之间吸附量差异极小,可重复性好,克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端

2. 操作安全,不需要使用有毒的苯酚等试剂,也不需要乙醇沉淀等步骤

3. 快速简捷,单个样品裂解后操作一般可在30分钟内完成

4. 多次柱漂洗确保高纯度,OD260/OD280典型的比值达1.7~1.9,可直接用于PCR、Southern-blot和各种酶切反应等实验

关于平衡液的使用:

1. 介绍:核酸吸附硅胶膜柱子长期放置过程中会同空气中的电荷/尘埃发生反应而影响其核酸的结合能力。硅胶柱经平衡液预处理后可大大减少柱子中硅胶膜的憎水基团,提高核酸的结合能力。从而提高硅胶柱子回收效率或者产量。平衡液是强碱性溶液,若不小心碰到,请用大量自来水清洗。用完后需盖紧瓶盖,以免接触空气。室温保存。在保存过程中可能有沉淀生成,请加热至37℃使沉淀完全消失。

2. 使用方法:取一个新的硅胶膜吸附柱子装在收集管中,吸取100μL的平衡液至柱子中。13,000rpm离心1分钟,倒掉收集管中废液,将吸附柱子重新放回收集管。此时平衡液预处理柱子完毕。接后续的操作步骤。

注意事项:

1. 所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机,如Eppendorf 5415C或者类似离心机。

2. 需要自备乙醇、异丙醇、β-巯基乙醇。

3. 开始实验前将需要的水浴先预热到37℃和70℃备用。

4. 结合液CB和抑制物去除液IR中含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗

5. 用户需要自备Sorbitol Buffer(1M 山梨醇,0.1M Na2EDTA,14mM β-巯基乙醇)。

配制方法:在600mL去离子水里面溶解182.2克山梨醇,加入200mL 0.5M Na2EDTA (pH 8.0),不需要调节PH值,定容到1L,4℃保存。临用前加0.2%β-巯基乙醇(商品化的β-巯基乙醇摩尔浓度一般为14M)

6. 菌体浓度检测一般OD600值为1的时候,酿酒酵母细胞是1-2x107 cells/mL,由于菌种和分光度计不同即使同样细胞数量OD值变化也很大,以上仅供参考。

7. 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA,不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱,但应该确保批pH大于7.5,pH过低影响洗脱效率。用水洗脱DNA应该保存在-20℃。DNA如果需要长期保存,可以用TE缓冲液洗脱(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA,pH 8.0),但是EDTA可能影响下游酶切反应,使用时可以适当稀释。

操作步骤(实验前请先阅读注意事项):

提示:第一次使用前请先在15mL漂洗液WB中加入60mL无水乙醇,充分混匀,加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!吸取使用量的Sorbitol Buffer加入0.2%β-巯基乙醇,回复到室温备用。

1. 取1-3mL酵母培养物(不超过3X107 cells,最好是早对数生长期),12,000rpm离心30秒,尽可能的吸弃上清,收集菌体。

注:收集超过1.5mL菌液,可以离心弃上清后,在同一个1.5mL管内加入更多的菌液,重复步骤1,直到收集到足够的菌体。

2. 加入300μL Sorbitol buffer,轻柔吹打充分重悬细胞;再加入50μL Lytic Enzyme储液,充分颠倒混匀,37℃温育1-3小时消化细胞壁,中间可颠倒数次帮助消化。

注:如果破壁效果不好导致产量低,可以加大Lytic Enzyme用量来提高酶工作浓度,还可以延长消化时间或者提高温度到45℃来提高效果,不适合Lytic Enzyme消化的酵母可选用其它方法如0.5mm玻璃珠涡旋击打,反复冻融等。玻璃珠法:向菌体中加入180μL缓冲液YB彻底悬浮菌体,加入0.1g直径为0.45-0.55mm的酸洗玻璃珠,涡旋振荡10分钟,静置几分钟让玻璃珠沉淀,小心吸取上清到一个新管后接后续步骤4。

3. 13,000rpm离心1分钟,尽可能吸弃上清,加180μL缓冲液YB充分重悬细胞团。

4. 加入20μL的蛋白酶K溶液(20mg/mL),立刻涡旋振荡充分混匀。

5. 将混合物放置在55℃水浴消化直到消化完全,期间轻柔的振荡几次帮助裂解。

注:所需消化时间和酵母数量、种类和生长状态有关,一般15分钟即可,但是如果方便的话消化过夜也无不良影响。

可选做步骤(一般不需要):如果RNA残留较多,需要去除RNA,可在完成操作步骤5后加20μL RNase A(25mg/mL)溶液,振荡混匀,室温放置5-10分钟。

6. 加入200μL结合液CB,立刻涡旋振荡充分混匀,70℃放置10分钟。   

平衡液预处理吸附柱备用:使用平衡液预处理硅胶膜吸附柱为必做步骤,具体方法参见前文“关于平衡液的使用”

7. 冷却后加入100μL异丙醇,立刻涡旋振荡充分混匀,此时可能会出现絮状沉淀。

8. 将上一步混合物(包括可能有的沉淀)加入一个吸附柱AC中,(吸附柱放入收集管中)13,000rpm离心30-60秒,倒掉收集管中的废液。

9. 加入500μL抑制物去除液IR,12,000rpm 离心30秒,弃废液。

10. 加入600μL漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000rpm 离心30秒,弃掉废液。

11. 加入600μL漂洗液WB,12,000rpm 离心30秒,弃掉废液。

12. 将吸附柱AC放回空收集管中,13,000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

13. 取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加100μL洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热效果更好),室温放置3-5分钟,12,000rpm 离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,室温放置2分钟,12,000rpm离心1分钟。

注:洗脱体积越大,洗脱效率越高,如果需要DNA浓度较高,可以适当减少洗脱体积,但是最小体积不应少于50μL,体积过小降低DNA洗脱效率,减少DNA产量。

14. DNA可以存放在2-8℃,如果要长时间存放,可以放置在-20℃。

问题与解决方法:

问题

   评论与建议

DNA产量低

*某些种类酵母裂解困难-建议:仔细阅读步骤2,确认处理的酵母种类可以用lytic Enzyme裂解,还可以考虑选用其它裂解方法如玻璃珠涡旋击打、煮沸、反复冻融等,使用早对数生长期酵母。

*蛋白酶K失效了-建议:按照每次使用量分装冻存,避免反复冻融,延长处理时间。

*裂解不完全或者和异丙醇没有充分混匀-建议:加入结合液后,和加入蛋白酶K后立即吹打或者涡旋混匀;加入异丙醇后立即吹打或者涡旋混匀才加入吸附柱,如果太粘稠必须涡旋振荡15秒充分混匀。

DNA降解了

*组织中核酸酶活性导致降解-建议:样品处理前妥善保存在-20℃,处理量不要过量。

未提取到DNA

*漂洗液WB中忘记加无水乙醇-建议:第一次实验时,在漂洗液WB中加入指定量无水乙醇。

洗脱下来的DNA

产量低

*离心柱残留有较多乙醇或者底部不慎沾有乙醇-建议:确保做了步骤12,否则残留乙醇会影响洗脱效率。

*使用了水或者其它非最佳液体代替洗脱缓冲液-建议:仔细阅读注意事项7和步骤13和只使用洗脱缓冲液EB洗脱。

A260吸光值异常

偏高

*一些硅基质膜成分一起洗脱下来,干扰了吸光值-建议:将洗脱的基因组DNA溶液13,000rpm再离心一分钟,小心取上清使用。

DNA下游酶切

不能切开或者

酶切不完全

*一些硅基质膜成分一起洗脱下来,抑制了酶切反应-建议:将洗脱的基因组DNA溶液13,000rpm再离心一分钟,小心取上清使用。

*离心柱残留有较多乙醇或者底部不慎沾有乙醇抑制了酶切反应-建议:确保做了步骤12,然后空气中晾几分钟,让残留乙醇挥发。

品牌: 爱普科学
产品别名: AipBest Yeast Genomic DNA Rapid Extraction Kit(Centrifugal Column)
规格: 50T
性状: 液体
储存温度: RT
保质期: 12个月
产品说明: 收到产品后,请尽快按照试剂盒内各组分的储存温度保存!
地址:北京市昌平区北清路1号珠江摩尔国际大厦5号楼2单元305
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