适用范围：适用于快速提取骨组织microRNA或者microRNA/总RNA分别提取。

产品储存：本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。不合适的储存于低温(4℃或者－20℃)会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下(15℃－25℃)进行。

产品介绍：

    本试剂盒配备的独家增强版的裂解液可以迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，独有的增强版裂解液可快速裂解骨组织样本，提取效果更强大。配备的植物RNA助提剂PlantAip帮助结合蛋白多糖等杂质并通过离心去除，然后裂解混合物通过基因组DNA清除柱，基因组DNA被清除而RNA(包括microRNA)被选择性滤过。滤过的RNA用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列特殊漂洗液快速的漂洗－离心的步骤，将细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的RNase-free Water将纯净的RNA(包括microRNA)从硅基质膜上洗脱。

    本试剂盒采用分提取操作步骤也可单独纯化富集后的microRNA组分和总RNA(>200 nt)，从而得到分离富集的microRNA和RNA。

    传统的microRNA提取试剂盒均是采用异硫氰酸胍/苯酚/氯仿(TRIzol法)加高浓度乙醇硅胶膜吸附小片段microRNA的原理方法制成，但是复杂的骨组织坚硬、骨细胞密度低、而且外周基质含有大量黏蛋白(蛋白多糖)和RNA难以分离，无法用传统Trizol法进行高质量提取RNA/microRNA。因此国内外知名公司采用Trizol法原理的microRNA提取试剂盒面临骨组织样品时束手无策，产品线中干脆就没有骨组织microRNA提取试剂盒。用户万般无奈只好用传统方法，或者TRIzol法提取，用异丙醇/乙醇沉淀方法来提取microRNA，虽然也能提取到部分microRNA，但是沉淀法损失巨大或者和杂质共沉淀，影响实验结果，在国际刊物投稿时常常面临质疑，甚至论文被撤销。而本试剂盒在我公司全球领先的RNA/microRNA提取技术的基础上，创新性的采用了不用苯酚、氯仿的技术路线，率先全球首家解决该问题，可以提取绝大多数骨组织microRNA样品。

产品特点：

1. 操作安全，完全不使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。

2. 快速简捷，全程操作只需12步，单个样品操作一般可在40分钟内完成。

3. 独有的植物RNA助提剂PlantAip可以有效结合多糖等杂质，提高清除效果。

4. 独有的裂解液可快速裂解骨组织样本，提取效果更强大。

5. 多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达2.0～2.2，可直接用于RT-PCR、Northern-Blot等相关分子生物学实验。

注意事项：

1. 第一次使用前请先在Wash Solution 1瓶和Wash Solution 2/3瓶中加入指定量乙醇，加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入。Wash Solution 2/3可能加入乙醇使用几天后出现沉淀晶体，并不影响使用，直接不吸晶体，吸上清使用即可。

2. 所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。

3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子密封保存。

4. 所有的离心步骤均可在室温完成(4℃离心也可以)，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机。

5. 需要自备乙醇，研钵(可选)等。

6. 样品处理量绝对不要超过基因组DNA清除柱和RNA吸附柱RA处理能力，否则造成DNA残留或产量降低。开始摸索实验条件时，如果不清楚样品DNA/RNA含量时可使用较少的样品处理量，将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。

7. 裂解液CLB和Wash Solution 1中含有刺激性化合物，操作时需穿防护服并佩戴一次性手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

8. 预防RNase污染及实验前的准备：经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。使用RNase-free的塑料制品和枪头避免交叉污染。RNA提取过程中应使用RNase-free的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH 中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。配制溶液应使用RNase-free的水或DEPC水(DEPC水的制备：将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%(v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌)。

9. 关于DNA的微量残留：一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留(DNase消化也无法做到100%无残留)，该产品由于采取了本公司独特的缓冲体系和基因组DNA清除柱技术，绝大多数DNA已经被清除，个别特殊情况需要清除微量基因组DNA残留，可使用以下几种DNA酶消化的方式。

1) 传统DNA酶消化提取的RNA/microRNA，热灭活DNA酶后直接用于后续实验。

2) 传统DNA酶消化提取的RNA/microRNA，然后使用RNA清洁纯化试剂盒(货号：RE281，但是需要将说明书改动一个地方，第二步加入250μL无水乙醇改成加入700μL无水乙醇)清洁纯化后用于后续实验。

3) 直接在吸附柱RA上进行DNase I 柱上消化处理。购买DNA酶柱上消化试剂盒(货号：RE280，但是需将说明书的去蛋白液RW1改成Wash Solution 1)可先索取具体操作说明书。

操作步骤(提取包含microRNA的总RNA)：

提示：第一次使用前请先在Wash Solution 1和Wash Solution 2/3瓶中按照标签提示加入指定量无水乙醇！并打钩做好标记避免重复加入！取1mL裂解液CLB至离心管内(如果CLB有析出或者沉淀需先置于65°C水浴重新溶解)，在裂解液CLB中加入100μL PlantAip，颠倒混匀后65°C水浴中预热。多个样品按照比例放大准备。此裂解液最好现用现配。

1. 液氮研磨法：

a. 骨钳夹碎骨组织后放入研钵(研钵在180度干烤2小时)，加入液氮后反复研磨成细粉，注意液氮蒸发后不断补加保存液氮一直存在。

b. 转移30mg-150mg细粉加至预热的裂解液CLB(已加有PlantAip)离心管中。立即剧烈涡旋振荡30-60秒或者用吸头吹打混匀裂解，直至得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒)，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。

注：骨组织差异极大，用户应该根据不同骨组织的具体情况和实验结果增减或者减少处理的样品量。以获得更好的产量和纯度。

c. 立刻接操作步骤的步骤3。

2. 其它骨组织破碎方法：

a. 取30mg-150mg骨组织加入1mL预热的裂解液CLB(已加有PlantAip)高速均质仪粉碎匀浆。或者取30mg-150mg液氮冷冻包埋切片粉碎的骨头加入裂解液CLB(已加有PlantAip)粉碎匀浆。

b. 立刻接操作步骤的步骤3。

3. 放回65℃水浴中水浴10 分钟，中间偶尔颠倒1-2次帮助充分裂解样本。

4. 将裂解物4℃ 13,000rpm离心10分钟，沉淀不能裂解的碎片。

5. 取500μL裂解物上清(在不超过基因组DNA清除柱能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量)，将裂解物上清加到DNA清除柱上(清除柱放在收集管内)。

6. 立即13,000rpm离心60秒，收集滤液(RNA在滤液中)。

7. 用微量移液器较精确估计滤过液体积(480μL左右，滤过时候损失体积应该减去)，加入1.25倍体积的无水乙醇，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。

8. 立刻将混合物(每次小于700μL，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，(吸附柱放入收集管中)13,000rpm离心30秒，弃掉废液。

注：确保离心后液体全部滤过，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。

9. 加入700μL Wash Solution 1(请先检查是否已加入无水乙醇!)，12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。

10. 加入500μL Wash Solution 2/3(请先检查是否已加入无水乙醇!)，12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500μL Wash Solution 2/3，重复操作一遍。

11. 将吸附柱RA放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

12. 取出吸附柱RA，放入新的RNase-free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μL RNase-free Water，室温放置1分钟，12,000rpm 离心1分钟，洗脱收集RNA溶液，得到的RNA/microRNA可以立即用于下游反应或尽快-70℃保存，防止降解。

注：将洗脱液重新加回到吸附柱按照步骤12重新洗脱一遍，可以提高产量约10-15%。如果预期RNA产量>30μg，加30-50μL RNase-free Water重复步骤12操作，合并两次洗脱液，分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%，但是浓度要低，用户根据实验需要自行选择。

附录1：microRNA相对富集方法(microRNA/去除了microRNA的总RNA分别提取)

提示：第一次使用前请先在Wash Solution 1和Wash Solution 2/3瓶中按照标签提示加入指定量无水乙醇！并打钩做好标记避免重复加入！取1mL裂解液CLB至离心管内(如果CLB有析出或者沉淀需先置于65°C水浴重新溶解)，在裂解液CLB中加入100μL PlantAip，颠倒混匀后65°C水浴中预热。多个样品按照比例放大准备。此裂解液最好现用现配。

1. 首先按照步骤1-4操作，准备好裂解匀浆液或者离心后的上清。

2. 取480μL裂解物上清(在不超过基因组DNA清除柱能力的情况下可以取更多的上清，这样可以提高产量，如残留基因组DNA较多，可适当减少取上清量)转到一个新离心管。加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积)，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。

3. 将混合物(每次小于720μL，多可以分两次加入)加入一个基因组清除柱中，(清除柱放入收集管中)13,000rpm离心2分钟，保留滤液(microRNA在滤液中)。

注：此时滤过液含有microRNA，基因组DNA清除柱内溶液是去除了microRNA的总RNA(不包含microRNA)，如果需要，可以按照前面标准操作步骤9-12操作，漂洗、洗脱回收得到去除了microRNA的总RNA。

4. 用微量移液器较精确估计滤过液体积，加入等体积无水乙醇(必须是室温!)，涡旋或者吹打充分混匀，不要离心。

5. 立刻将混合物(每次小于700μL，多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中，(吸附柱放入收集管中)13,000rpm离心2分钟，弃掉废液。

注：确保离心后液体全部滤过，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。

6. 按照前面标准操作步骤9-12操作，漂洗、洗脱得到富集的microRNA。

注意：不同的实验可以选择不同的方法，例如Northern Blot或者表达芯片谱分析可以选择提取包括microRNA的总RNA。相对富集方法提取的microRNA因为去除了较大片段的mRNA和rRNA等，可能减少某些下游试验的扩增背景，当背景较高或者非特异扩增较多时，可以尝试使用相对富集方法提取的microRNA。

附录2：DNA酶柱上消化(详细请参考RE280/DNase I 柱上消化试剂盒说明书)

1. 按照前面所列操作步骤操作，直到做完操作步骤1-8。

2. 取45μL DNase I Buffer和5μL RNase-free DNase I在离心管内轻轻吹打混匀，配制成DNase I工作液

注：处理多个离心柱子要按照比例放大制备工作液。

3. 向吸附柱RA中加入350μL Wash Solution 1，12,000rpm 离心30秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

4. 向吸附柱RA中央加入50μL的DNase I 工作液，室温(20℃-30℃)放置15分钟。

注：直接将工作液滴在膜中央上向膜四周浸润充分和膜接触，不要让工作液滴在O型垫圈上，或离心柱管壁上挂壁，或挂在垫圈上不能充分和膜接触。

5. 向吸附柱RA中加入350μL Wash Solution 1，12,000rpm 离心30-60秒，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

6. 立即接操作步骤10，完成后续实验步骤。

产品说明书.pdf