适用范围：适用于快速从福尔马林固定、石蜡包埋组织样品中提取RNA包括miRNA。

产品储存：本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

储存事项：

1. 所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。

2. 不合适的储存于低温(4℃或者－20℃)会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下(15℃－25℃)进行。

3. 蛋白酶K保存在即用型甘油缓冲液中，常温运输。收到后，不超过25℃室温至少保存6个月，4℃保存12个月，－20℃保存2年。

4. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

产品介绍：本试剂盒设计用于快速从福尔马林固定、石蜡包埋组织样品中提取RNA包括microRNA。独特的裂解液/蛋白酶K迅速裂解细胞释放出RNA，然后裂解混合物通过一个基因组DNA清除柱，基因组DNA被清除而RNA穿透滤过。滤过的RNA用乙醇调节结合条件后，RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的RNase-free Water将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。得到的RNA可用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。

产品特点：

1. 操作安全，完全不使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。

2. 快速简捷，全程操作只需10步，单个样品RNA提取操作一般可在1小时内完成。

3. 试剂盒的独家基因组清除柱和配方，确保有效清除基因组DNA残留，一般情况下得到的RNA不需要DNase消化，可直接用于反转录PCR、荧光定量PCR等实验。

4. 多次柱漂洗确保RNA高纯度，得到的RNA可直接用于下游各种实验。

注意事项：

1. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机。

2. 样品处理量绝对不要超过基因组DNA清除柱和RNA吸附柱RA处理能力，否则造成DNA残留或者产量降低。不同组织细胞种类RNA/DNA相差极大，例如胸腺脾脏DNA含量丰富，超过5mg就会超过柱子处理能力。COS细胞RNA含量丰富，超过3x106细胞就会超过柱子吸附能力。所以开始摸索实验条件时，如果不清楚样品DNA/RNA含量时宁可使用较少的样品处理量，如不超过2个10μm厚度石蜡切片。实验条件摸索后，将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。

3. 裂解液PKD、结合液RBC中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。

4. 预防RNase污染及实验前的准备：经常更换新手套，因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。使用RNase-free的塑料制品和枪头避免交叉污染。RNA提取过程中应使用RNase-free的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH 中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。配制溶液应使用RNase-free的水或DEPC水(DEPC水的制备：将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.1%(v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌)。

5. 关于DNA的微量残留：一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留(DNase消化也无法做到100%无残留)，本公司的AipEasy固定包埋组织microRNA快速提取试剂盒，由于采取了本公司独特的缓冲体系和基因组DNA清除柱技术，绝大多数DNA已经被清除，可直接用于反转录PCR和荧光定量PCR。个别特殊情况如DNA含量过于丰富造成残留或者要进行严格的mRNA表达量分析荧光定量PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时：

1) 选用跨内含子的引物，以穿过mRNA中的连接区，这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。

2) 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。

6. RNA纯度及浓度检测：

完整性：RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：胶浓度1.2%；0.5×TBE电泳缓冲液；150v，15分钟)检测完整性。由于石蜡包埋组织福尔马林固定和包埋过程中一般由于RNA与蛋白反应交联会导致RNA断裂或者降解，一般电泳后UV下只能看到模糊弥散(smear)带型，随着储存的时间越长，降解断裂越严重，甚至只能看到峰值仅仅在100bp左右的模糊条带。这都属于RNA提取正常情况。

纯度：OD260/OD280比值是衡量蛋白质污染程度的参考指标。高质量的RNA，OD260/OD280读数(10mM Tris，pH7.5)在1.8-2.1之间。OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品，假定在10mM Tris，pH7.5溶液中测出的OD260/OD280读数1.8-2.1之间，在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间，但这并不表示RNA不纯。

浓度：取一定量的RNA提取物，用RNase-free水稀释n倍，用RNase-free水将分光光度计调零，取稀释液进行OD260和OD280测定，按照以下公式进行RNA浓度的计算：终浓度(ng/μL)=(OD260)×(稀释倍数n)×40。

操作步骤(提取包含microRNA的总RNA)：

提示：第一次使用前请先在漂洗液RW瓶中按照标签提示加入指定量无水乙醇！并打钩做好标记避免重复加入！

1. 样本处理

2. 吹打或者涡旋振荡充分重悬组织沉淀在■140μL ▲230μL裂解液PKD中，短暂离心收集液体到管底，加20μL蛋白酶K，吹打混匀。

3. 55℃孵育15分钟，然后80℃孵育15分钟。

注：55℃孵育后，可以将离心管取出放置在室温，等水浴锅温度升到80℃后再放入水浴锅，精确的孵育15分钟。即使2分钟的延长也可能导致RNA的部分降解。

4. 加入■320μL ▲500μL结合液RBC，充分吹打混匀调节结合条件。

5. 立刻将混合物加入一个基因组DNA清除柱中，(清除柱放入收集管中)14,000rpm离心30秒，保留滤过液(RNAmicroRNA在滤过液中)。

注：应避免吸到可能有的较大的未消化完全的絮团物质上柱子，以免堵塞离心柱。

6. 加入■1120μL ▲1750μL无水乙醇到滤过液中，立即吹打混匀，不要离心。

注：如果加1750μL无水乙醇，应先将滤过液转到容量超过3mL的离心管后再加入。

7. 立刻将混合物(每次小于700μL，多可以分多次加入)加入一个RNA吸附柱RA中，(吸附柱放入收集管中)13,000rpm离心30秒，弃掉废液。

8. 加入500μL漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇!)，12,000rpm 离心30秒，弃掉废液。加入500μL漂洗液RW，重复操作一遍。

9. 将吸附柱RA放回空收集管中，13,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

10. 取出吸附柱RA，放入一个RNase-free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30μL RNase-free Water(事先在70-90℃水浴中加热可提高产量)，室温放置1分钟，12,000rpm 离心1分钟，RNA被洗脱下来收集在离心管中，-70℃保存RNA，防止降解。

注：如果预期RNA产量>30μg，加30-50μL RNase-free Water重复步骤10操作，合并两次洗脱液；如果需要RNA浓度高，可使用第一次的洗脱液重新加回到吸附柱重复步骤操作10。洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高，分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量高，比前者高15–30%，但是浓度要低，用户根据实验需要自行选择。

产品说明书.pdf