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SuperKOD DNA Polymerase(With UltraPure dNTP Mixture)

货号:NS009-01

品牌:爱普科学

货期:现货

价格:420

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产品储存:4℃运输,-20℃保存,有效期24个月。

制品说明:KOD DNA Polymerase是从克隆有Thermococcus Kodakaraensis DNA聚合酶基因的质粒在大肠杆菌中经诱导表达分离纯化而来。该酶所具有的超强3'→ 5'外切酶活性使得其扩增保真性比Pfu DNA Polymerase更高,保真性是Taq的约50倍,同时具有合成速度快的特点,聚合速度约为普通Pfu DNA Polymerase的5倍,Taq DNA Polymerase 的2倍,达到100-138bp/秒,可以在短时间内获得高产量的扩增产物,特别适合于高保真地扩增6kb以内的PCR 产物,扩增所得的DNA为平末端,可用于基因克隆、表达及突变分析等分子生物学实验。

活性定义:75°C活性测定条件下,在30min 内摄入10nmoles 的dNTPs 使成为酸性不溶物时所需要酶的活性定义为1U。

产品用途:主要用于PCR扩增,尤其用于PCR产物的克隆,DNA片段的平滑化

建议PCR条件:(以50μL反应体系为例)

Components

Volume(50μL)

Final Concentration

Template

Variable

<0.5μg

Forward Primer 10μM

1μL

0.2μM

Reverse Primer 10μM

1μL

0.2μM

10× SuperKOD Buffer

5μL

UltraDNTP Mix (10mM each)

1μL

0.2mM

SuperKOD DNA Polymerase

0.25-0.5μL(1.25-2.5 U)

-

ddH2O

Up to 50μL


注:用无菌PCR级别的水补至终体积50μL。实际操作中计算好需补加水的量后,建议先加水,然后按上述顺序添加其它成分,最后添加KOD DNA Polymerase。充分混匀后,离心数秒使反应混合物沉到管底。然后将反应管置于PCR仪中进行扩增。

注:在冰浴上混合PCR各种成分,防止KOD DNA聚合酶降解引物和模板。

PCR条件的优化:

1. 质粒或者噬菌体模板:(模板量5-20ng,循环参数如下表)

Cycling Parameters

<1kbp Target DNA

1-2kbp Target DNA

3-4kbp Target DNA

5-6kbp Target DNA

Step 1

94°C/2 min

94°C/2 min

94°C/2 min

94°C/2 min

Step 2

94°C/20 sec

94°C/20 sec

94°C/20 sec

94°C/30 sec

Step 3

Ta/20 sec

Ta/20 sec

Ta/20 sec

Ta/30 sec

Step 4

72°C/5-15 sec

72°C/20-30 sec

72°C/40-50 sec

72°C/60-70 sec

Step 5

72°C/5 min

72°C/5 min

72°C/5 min

72°C/5 min

Repeat step 2-4 for 30-35cycles

Ta= Tm5°C

2. 基因组DNA和cDNA模板:(基因组DNA模板量为50-100ng,1-2μL cDNA(起始转录用的RNA为500ng),循环参数如下表)

Cycling Parameters

<2kbp Target DNA

Step 1

94°C/2 min

Step 2

94°C/20-30 sec

Step 3

Ta/15-20 sec

Step 4

72°C/20-60 sec

Step 5

72°C/5 min

Repeat step 2-4 for 30-35 cycles

Ta= Tm - 5°C

注意事项:

1. 高保真KOD对于dNTP纯度要求很高,因此建议用本酶配套的超纯dNTP Mix。

2. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

3. 本制品仅供科研使用,严禁用于临床诊断和药物等用途。

问题与解决方法:

问题

可能的原因

解决方法

没有PCR产物

设计的扩增靶序列太长。

设计稍短的扩增靶序列,以基因组DNA为模板KOD适合扩增不超过2kb左右的产物,以质粒和噬菌体DNA为模板适合扩增6kb以下的DNA。

PCR条带弥散

1. 没有在冰上混合PCR反应液。

2. KOD扩增延伸速度为1kb/15-30秒,具有比其它聚合酶更快的延伸速度和延伸时间过长,有时会有拖尾弥散效应。

1. PCR反应液应该在冰上混合。

2. KOD DNA聚合酶应该最后加入,以防止KOD DNA聚合酶降解引物和模板。如出现拖尾效应,可缩短退火延伸时间或者减少酶量。

低产量

1. 模板为高GC含量。

2. 模板量太低。

1. 加入DMSO 2-5%,由于该酶的耐热性好,在应用于GC 含量高的模板等以及易产生高级结构的模板时,可在96℃以上进行变性。

2. 提高模板量。

品牌: 爱普科学
产品别名: SuperKOD DNA聚合酶(含超纯dNTP混合液)
规格: 250U/500U
性状: 液体
储存温度: -20℃
保质期: 24个月
产品说明: 新!KOD酶是高保真酶,对于dNTP纯度要求极高,本公司KOD酶已经自带超纯dNTP mixture。
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