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AipEasy 组织/细胞RNA快速提取试剂盒(离心柱型)

货号:RE240-01

品牌:爱普科学

货期:现货

价格:820

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适用范围:适用于快速提取普通动物细胞和易裂解动物组织总RNA

产品储存:本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

储存事项:

1. 所有的溶液应该是澄清的,如果环境温度低时溶液可能形成沉淀,此时不应该直接使用,可在37℃水浴加热几分钟,即可恢复澄清。

2. 不合适的储存于低温(4℃或者-20℃)会造成溶液沉淀,影响使用效果,因此运输和储存均在室温下(15℃-25℃)进行。

3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。

产品介绍:独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶,然后用乙醇调节结合条件后,RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物,蛋白等杂质去除,最后低盐的RNase free Water将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

产品特点:

1. 完全不使用有毒的苯酚、氯仿、Beta巯基乙醇等试剂,也不需要乙醇沉淀等步骤

2. 快速简捷,单个细胞样品操作一般可在10分钟内完成

3. 多次柱漂洗确保高纯度,OD260/OD280典型的比值达2.1-2.2(100%纯的RNA比值一般是2.2左右,很多公司的产品因为残留蛋白或者DNA较多,造成比值降低,无法达到2.2这个纯度标准,因此降低要求1.9-2.0就凑合使用了,但是爱普科学的产品标准一般可以达到高水准的2.1-2.2的纯度标准)

注意事项:

1. 的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000rpm 的台式离心机即可。

2. 品处理量绝对不要超出RNA吸附柱RA的处理能力,否则可能反而造成产量降低。不同组织细胞种类RNA相差极大,COS细胞RNA含量丰富,超过3x106细胞就会超过柱子吸附能力。所以开始摸索实验条件时,如果不清楚样品RNA含量时宁可使用较少的样品处理量,如细胞不超过3-4x106,组织不超过10mg。将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。

3. 裂解液RLT和去蛋白液RW1中含有盐酸胍/异硫氰酸胍化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗

4. 预防RNase污染,应注意以下几方面:

1) 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌,可能导致RNase污染。

2) 使用RNase-free的塑料制品和枪头避免交叉污染。

3) RNA在裂解液RLT中时不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用RNase-free的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4小时,塑料器皿可在0.5 M NaOH中浸泡10分钟,然后用水彻底清洗,再灭菌,即可去除RNase。

4) 配制溶液应使用RNase-free的水。(将水加入到干净的玻璃瓶中,加入DEPC至终浓度0.1%(v/v),37℃放置过夜,高压灭菌。)

5. 关于DNA的微量残留:一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留(DNase消化也无法做到100%无残留),本公司的EASYspin RNA提取产品,由于采取了本公司独特的缓冲体系和基因组DNA清除柱技术,绝大多数DNA已经被清除,不需要DNase消化,可直接用于反转录PCR和荧光定量PCR。个别特殊情况如DNA含量过于丰富造成残留或者要进行严格的mRNA表达量分析荧光定量PCR,我们建议在进行模板和引物的选择时:

1) 选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接,这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。

2) 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。

3) 将RNA提取物用RNase-free的DNase I 处理以提高效果。试剂盒还可以用于DNase I 处理后的RNA清洁(Clean up),请联系我们索取具体操作说明书

4) 在步骤去蛋白液RW1漂洗前,直接在吸附柱RA上进行DNase I 处理。请联系我们索取具体操作说明书(爱普科学DNA酶柱上消化试剂盒,货号:RE280)

6. RNA纯度及浓度检测:

完整性:RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件:胶浓度1.2%,0.5× TBE电泳缓冲液,150v,15分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA为rRNA,电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为2kb和1kb,分别相当于28S和18S rRNA。动物RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍,否则提示RNA样品的降解。出现小的弥散片状或条带消失表明样品严重降解。但是应该注意区分是提取出来的RNA样品本身降解了,还是提取出来的RNA是完好的,只是在电泳过程中降解的。

纯度:OD260/OD280比值是衡量蛋白质污染程度的参考指标。高质量的RNA,OD260/OD280读数在2.1-2.2之间100%纯的RNA比值一般是2.2左右(100%纯的RNA比值一般是2.2左右,很多公司的产品因为残留蛋白或者DNA较多,造成比值降低,无法达到2.2这个纯度标准,因此降低要求1.9-2.0就凑合使用了,但是爱普科学的产品标准一般可以达到高水准的2.1-2.2的纯度标准)。OD260/OD280读数受测量使用的机器影响,也受测定所用稀释溶液的pH值影响。微量分光光度计一般不需要稀释,不受稀释溶液的PH值影响。但是同一个RNA样品,如果测量的时候机器要求稀释后测量,假定在10mM Tris,pH7.5稀释溶液中测出的OD260/OD280读数1.9-2.1之间,在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间,但这并不表示RNA不纯。

浓度:取一定量的RNA提取物,用RNase-free水稀释n倍,用RNase-free水将分光光度计调零,取稀释液进行OD260和OD280测定,按照以下公式进行RNA浓度的计算:终浓度(ng/μL)=(OD260)×(稀释倍数n)×40

操作步骤(实验前请先阅读注意事项):

提示:第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇!

1. 培养细胞

A1. 贴壁细胞:不需消化,彻底吸干净培养液体后直接加推荐量裂解液RLT(见附录一)反复吹打细胞裂解(裂解后直接接操作步骤项3);不方便直接裂解的培养容器,可以用细胞刮子刮下细胞,或者胰蛋白酶消化后吹打下来收集细胞到1.5mL离心管。

A2. 悬浮细胞:收集<107悬浮细胞到一个1.5mL离心管。

B. 13,000rpm 离心10秒(或者300g离心5分钟),使细胞沉淀下来。完全吸弃上清,留下细胞团,注意不完全弃上清会稀释裂解液导致产量纯度降低。

C. 轻弹离心管底部,使细胞沉淀松散,加350μL(<5x106细胞)或600μL(5x106-1x107细胞)裂解液RLT,用移液器反复吹打充分裂解(直到看不细胞团为止)。

D. 立刻接操作步骤项下3。

2. 动物组织(例如鼠肝脑)

A1. 浆器匀浆:新鲜组织加入350μL(<20mg组织)或者600μL(20-30mg组织)的裂解液RLT后玻璃匀浆器或电动匀浆器将组织彻底研磨匀浆。

A2. 液氮研磨+匀浆:在液氮中研磨组织成细粉后,取适量组织细粉(20mg/30mg)转入装有350μL/600μL组织裂解液RLT的1.5mL离心管中,剧烈振荡20秒,难裂解样品可用移液器反复吹打匀浆。

注:若研磨匀浆后不溶物碎片太多,可将匀浆后裂解物13,000rpm 离心3分钟沉淀可能存在的裂解困难的碎片或者不溶物。将上清液转移到新的1.5mL离心管内。

B. 立刻接操作步骤项下3

3. 较精确估计裂解物(上清)体积,加入等体积的70%乙醇(请先检查是否已加入无水乙醇!),此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。

4. 立刻将混合物(每次小于720μL,多可以分两次加入)加入一个吸附柱RA中,(吸附柱放入收集管中)13,000rpm 离心30秒,弃掉废液。

5. 加700μL 去蛋白液RW1,室温放置30秒,13,000rpm 离心30秒,弃掉废液。

6. 加入500μL漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇!),13,000rpm 离心30秒,弃掉废液。加入500μL漂洗液RW,重复一遍。

7. 将吸附柱RA放回空收集管中,13,000rpm 离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

8. 取出吸附柱RA,放入一个干净1.5mL离心管中,根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μL RNase-free Water, 室温放置1分钟,13,000rpm 离心1分钟得到RNA溶液。

注:洗脱缓冲液体积不应少于30 μL,体积过小影响回收效率。如果需要得到更大浓度的RNA,将离心得到的RNA溶液加回到吸附柱重复洗脱一遍。

附录一:贴壁培养细胞数量表

培养器皿

底面积(cm2)

加培养液量(mL)

可获细胞量

24孔培养板

2

1.0

5×105

6孔培养板

9.6

2.5

2.5×106

3.5cm培养皿

8

3.0

2.0×106

6cm培养皿

21 

5.0

5.2×106

25cm塑料培养瓶

25

5.0

5.2×106

100mL玻璃培养瓶

33

10.0

7×106

注:一般情况下,3.5cm直径培养皿或者更小培养容器加350μL裂解液RLT,6cm直径培养皿或者更大培养容器加600μL裂解液RLT。最大处理量不超过107个细胞。

品牌: 爱普科学
产品别名: AipEasy Tissue/Cell RNA Rapid Extraction Kit(Centrifugal Column)
规格: 50T/100T
性状: 液体
储存温度: RT
保质期: 12个月
产品说明: 收到产品后,请尽快按照试剂盒内各组分的储存温度保存!
地址:北京市昌平区北清路1号珠江摩尔国际大厦5号楼2单元305
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