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适用范围:适用于快速大量提取植物组织细胞总RNA。
产品储存:本试剂盒在室温储存6个月不影响使用效果。
储存事项:
1. 所有的溶液应该是澄清的,如果环境温度低时溶液可能形成沉淀,此时不应该直接使用,可在37℃水浴加热几分钟,即可恢复澄清。
2. 不合适的储存于低温(4℃或者-20℃)会造成溶液沉淀,影响使用效果,因此运输和储存均在室温下(15℃-25℃)进行。
3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
产品介绍:独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶,植物RNA助提剂PlantAip帮助结合多糖多酚并通过离心去除,然后用乙醇调节结合条件后,RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜,再通过一系列快速的漂洗-离心的步骤,去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物,蛋白等杂质去除,最后低盐的RNase-free Water将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。
产品特点:
1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜,柱与柱之间吸附量差异极小,可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2. 不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂,也不需要乙醇沉淀等步骤。
3. 快速简捷,单个样品操作一般可在60分钟内完成。
4. 独有的植物RNA助提剂可以有效结合多糖多酚,提高清除效果。
5. 多次柱漂洗确保高纯度,OD260/OD280典型的比值达1.9~2.0,基本无DNA残留,可用于RT-PCR,Northern-blot和各种实验。
注意事项:
1. 所有的离心步骤均可在室温完成,使用可容纳50mL离心管的离心机。
2. 需要自备乙醇,一次性注射器(可选),研钵。
3. 裂解液RLT和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物,操作时要戴乳胶手套,避免沾染皮肤,眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时,要用大量清水或者生理盐水冲洗。
4. 关于DNA的微量残留:一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留,本公司的AipEasy系列RNA提取产品,由于采取了本公司独特的缓冲体系和选择了特殊吸附能力的吸附膜,在大多数RT-PCR扩增过程中极其微量的DNA残留(一般电泳EB染色紫外灯下观察不可见)影响不是很大,如果要进行严格的mRNA表达量分析如荧光定量PCR,我们建议在进行模板和引物的选择时:
1) 选用跨内含子的引物,以穿过mRNA中的连接区,这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。
2) 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。
3) 将RNA提取物用RNase-free的DNase I处理。本试剂盒还可以用于DNase I处理后的RNA清洁(Clean up),请联系我们索取具体操作说明书。
4) 在步骤去蛋白液RW1漂洗前,直接在吸附柱RA上进行DNase I处理。请联系我们索取具体操作说明书。
5. RNA纯度及浓度检测:
完整性:RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳(电泳条件:胶浓度1.2%,0.5×TBE电泳缓冲液,150v,15分钟)检测完整性。由于细胞中70%-80%的RNA为rRNA,电泳后UV下应能看到非常明显的rRNA条带。动物rRNA大小分别约为5kb和2kb,分别相当于28S和18S rRNA。动物RNA样品中最大rRNA亮度应为次大rRNA亮度的1.5-2.0倍,否则表示RNA样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
纯度:OD260/OD280比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的RNA,OD260/OD280读数(10mM Tris,pH 7.5)在1.8-2.1之间。OD260/OD280读数受测定所用溶液的pH值影响。同一个RNA样品,假定在10mM Tris,pH 7.5溶液中测出的OD260/OD280读数1.8-2.1之间,在水溶液中所测读数则可能在1.5-1.9之间,但这并不表示RNA不纯。
浓度:取一定量的RNA提取物,用RNase-free水稀释n倍,用RNase-free水将分光光度计调零,取稀释液进行OD260和OD280测定,按照以下公式进行RNA浓度的计算:终浓度(ng/μL)=(OD260)×(稀释倍数n)×40。
操作步骤(实验前请先阅读注意事项):
提示:第一次使用前请先在漂洗液RW瓶加入指定量无水乙醇!
1. 直接研磨法(推荐):
a. 新鲜植物组织称重后取1-2g迅速剪成小块放入研钵(冰冻保存或者液氮保存样品可直接称重后取1-2g放入研钵),加入10体积(10mL)RLT和1体积(1mL)PlantAip室温下充分研磨成匀浆,注意应该迅速研磨让组织和裂解液RLT立刻充分接触以抑制RNA酶活性。
注:PlantAip是提取多糖多酚含量丰富的困难样品不可缺少成分。提取普通植物组织可以不加PPlantAip,RNA产量可能会提高一些。
b. 将裂解物转入离心管,剧烈摇晃振荡15秒,10,000-13,000 xg离心10分钟(如果离心机转速低,可适当延长离心时间),沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的PlantAip,小心取裂解物上清(需计算体积)转到一个新离心管。
c. 加入上清体积一半的无水乙醇(0.5体积),此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即剧烈振荡混匀,不要离心。
d. 立刻接操作步骤项下3。
2. 液氮研磨法:
a. 取10mL裂解液RLT,转入50mL离心管中,加入1mL PlantAip混匀备用。
b. 液氮中研磨适量植物组织成细粉后,取1-2g细粉转入上述装有RLT和PlantAip的离心管,立即用手剧烈振荡20秒,充分裂解。
注:在56℃温育1-3分钟有助于裂解植物,但是淀粉含量高的植物不能温育,因为提高的温度可能导致淀粉膨胀。
c. 用带钝针头的一次性5mL(配0.9mm针头)注射器抽打裂解物10次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高产量。
d. 将裂解物10,000-13,000xg离心10分钟,沉淀不能裂解的碎片和结合有多糖多酚的PlantAip,将所有裂解物上清转到一个新离心管。
e. 较精确估计裂解物(上清)体积,加入0.5体积的无水乙醇,此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即剧烈振荡混匀,不要离心。
f. 立刻接操作步骤项下3。
3. 将混合物加入一个吸附柱RA中,(吸附柱放入收集管中)10,000-13,000xg离心5分钟(确保全部通过,膜上无残留液体,否则应加大转速和时间),弃掉废液。
4. 加6mL去蛋白液RW1,室温放置1分钟,12,000xg 离心3分钟,弃掉废液。
5. 加入10mL漂洗液RW(请先检查是否已加入无水乙醇!),10,000-13,000xg离心1-2分钟,弃掉废液。加入10mL漂洗液RW,重复一遍。
6. 将吸附柱RA放回空收集管中,13,000xg离心5分钟以干燥膜基质残留乙醇,用枪头吸除内圈压环和柱壁之间可能残留的乙醇,室温或者烘箱晾干几分钟。
7. 取出吸附柱RA,放入一个RNase-free离心管中,根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加500μL—1mL RNase-free Water(事先在70-90℃水浴中加热效果更好),室温放置3分钟,12,000xg 离心2分钟。
8. 如果预期RNA产量>0.6mg,加300-500μL RNase-free Water重复步骤7,合并两次洗脱液,或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要RNA浓度高)。
注:洗脱两遍的RNA洗脱液浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的RNA产量比前者高15–30%,但是浓度要低,用户根据需要选择。
品牌: | 爱普科学 |
英文名称: | AipEasy Universal Plant RNA Rapid Maxi Kit(Centrifugal Column) |
规格: | 10T |
性状: | 液体 |
储存温度: | RT |
保质期: | 12个月 |
产品说明: | 收到产品后,请尽快按照试剂盒内各组分的储存温度保存! |
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