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产品储存:本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。内毒素清除剂常温运输,4度可以保存一个月,-20℃长期保存。
储存事项:
1. 第一次使用时,将试剂盒所带的全部RNase A加入溶液P1后(终浓度100ug/mL)置于2-8℃保存。如果溶液P1中RNase A失活,提取的质粒可能会有微量RNA残留,在溶液P1中补加RNase A即可。
2. 环境温度低时溶液P2中SDS可能会析出浑浊或者沉淀,可在37℃水浴加热几分钟,即可恢复澄清,不要剧烈摇晃,以免形成过量的泡沫。
3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化,各溶液使用后应及时盖紧盖子。
产品介绍:
本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞,通过爱普科学独特的内毒素清除剂选择性结合离心除去内毒素,然后离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA,再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除,最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
本试剂盒配备了爱普科学独特的专用内毒素清除剂,提取的质粒纯度非常高,提取的质粒内毒素含量极低(<0.1 EU/ug DNA),提取的质粒除用于常规的PCR、酶切、转化等实验外,还非常适合用于原生质体转染实验。
产品特点:
1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜,柱与柱之间吸附量差异极小,可重复性好,克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2. 不需要使用有毒的苯酚,氯仿等试剂,也不需要乙醇沉淀。
3. 快速方便,从1.5-4.5mL过夜培养的菌液中,可提取出高达20µg-50µg纯净的高拷贝DNA质粒。
4. 独特工艺配方清除内毒素,内毒素含量极低(<0.1 EU/μg DNA),细胞转染效果极佳。也可直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序、等各种分子生物学实验。
注意事项:
1. 所有的离心步骤均在室温完成,使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机,如Eppendorf 5415C或者类似离心机。
2. 提取质粒的量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。一般高拷贝质粒,建议接种单菌落于1.5-4.5mL加合适抗生素的LB培养基,过夜培养14-16个小时,可提取出多达20µg-50µg的纯净质粒。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒,应适当加大菌体使用量,使用5-10mL过夜培养物,同时按比例增加P1、P2、N3的用量,其它步骤相同。
3. 得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50μg/mL DNA。电泳可能为单一条带,也可能为2条或者多条DNA条带,这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成,与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。
4. 质粒DNA确切分子大小,必须酶切线性化后,对比DNA分子量Marker才可以知道。处于环状或者超螺旋状态的的质粒,泳动位置不确定,无法通过电泳知道其确切大小。
5. 洗脱液EB不含有螯合剂EDTA,不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱,但应该确保pH大于7.5,pH过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在-20℃。质粒DNA如果需要长期保存,可以用TE缓冲液洗脱(10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH 8.0),但是EDTA可能影响下游酶切反应,使用时可以适当稀释。
关于平衡液的使用:
1. 介绍:核酸吸附硅胶膜柱子长期放置过程中会同空气中的电荷/尘埃发生反应而影响其核酸的结合能力。硅胶柱经平衡液预处理后可大大减少柱子中硅胶膜的憎水基团,提高核酸的结合能力。从而提高硅胶柱子回收效率或者产量。平衡液是强碱性溶液,若不小心碰到,请用大量自来水清洗。用完后需盖紧瓶盖,以免接触空气。室温保存。在保存过程中可能有沉淀生成,请加热至37℃使沉淀完全消失。
2. 使用方法:取一个新的硅胶膜吸附柱子装在收集管中,吸取100μL的平衡液至柱子中。13000rpm 离心1分钟,倒掉收集管中废液,将吸附柱子重新放回收集管。此时平衡液预处理柱子完毕。接后续的操作步骤。
操作步骤(实验前请先阅读注意事项):
提示:第一次使用前请先在漂洗液WB和去蛋白液PE瓶中按照该组分标签上的指示,加入指定量无水乙醇,充分混匀,加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇,以免多次加入!将RNase A全部加入溶液P1中,混匀,每次使用后置于2-8℃保存。
1. 取1.5-4.5mL过夜培养的菌液,12,000rpm离心30秒,尽可能的倒干上清,收集菌体。
注:收集超过1.5mL菌液,可以离心弃上清后,在同一个1.5mL管内加入更多的菌液,重复步骤1,直到收集到足够的菌体。
2. 用250μL溶液P1重悬菌体沉淀,涡旋振荡至彻底悬浮。
注:如果有未彻底混匀的菌块,会影响裂解,导致提取量和纯度偏低。
3. 加250μL的溶液P2,温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解,室温放置4分钟。
注:温和地混合,不要剧烈震荡,以免基因组DNA剪切断裂!所用时间不应超过5分钟!以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠,如果菌体少,很快清亮粘稠后就可以做下一步,不是一定要准确的5分钟。
4. 加250μL溶液N3,立即温和地上下翻转6-8次,充分混匀时会出现白色絮状沉淀。13,000rpm离心10分钟,小心取上清至新管,避免吸取到漂浮白色沉淀。
注:加入溶液N3后应该立即混匀,以免产生SDS的局部沉淀。
5. 加入0.1体积(上清的体积的10%,约80µL)的内毒素清除剂到上一步所得上清,颠倒旋转混匀,冰浴或者插入碎冰中(或冰箱冷冻室)放置5分钟直到浑浊变清亮透明(或仍旧稍有浑浊),中间偶尔混匀几次。
注:内毒素清除剂加入上清后,上清会变得浑浊,但是冰浴后应恢复清亮(或稍浑浊)。
6. 常温放置3-5分钟,温度恢复室温溶液很快变为浑浊,颠倒混匀。
注:如室内温度较低或者想加快速度可以在37-42℃水浴,将很快变浑浊,颠倒混匀。
7. 室温14,000xg 离心10分钟分相。上层水相含DNA,下层蓝色油状相含内毒素和其它杂质。将含DNA的上层水相转移到新管(注意不要吸到蓝色油状层,里面含内毒素等杂质),弃油状层。
注:平衡液预处理吸附柱:使用平衡液预处理硅胶膜吸附柱为必做步骤,具体方法参见前文“关于平衡液的使用”
8. 向上层水相中加入0.5体积异丙醇(约370µL)后充分颠倒混匀后分两次(每次不超过700µL)转入吸附柱AC中(吸附柱放入收集管中),12,000xg 离心1分钟,倒掉收集管中的废液。直到所有混合溶液通过此吸附柱。
9. 加入500μL去蛋白液PE,12,000rpm 离心30秒,弃废液。
注:此步骤为了去除痕量核酸酶等杂质,如所用菌株为JM系列、HB101等endA菌株或野生型菌株,核酸酶含量丰富,应加此步骤;如所用菌株为XL-1 Blue、Top10和DH5α等缺陷型菌株,核酸酶含量低,则可略过此步骤。
10. 加入600μL漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇!),12,000rpm 离心30秒,弃掉废液。再加入600μL漂洗液WB,重复漂洗一次。
11. 将吸附柱AC放回空收集管中,12,000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
12. 取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加50-100μL洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中加热效果更好),室温放置2分钟,12,000rpm 离心1分钟。如果需要较多量质粒,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中,室温放置2分钟,离心1分钟。
注:洗脱体积越大,洗脱效率越高。如果需要质粒浓度较高,可以适当减少洗脱体积,但是最小体积不应少于30μL,体积过小降低质粒洗脱效率,减少质粒产量。
品牌: | 爱普科学 |
英文名称: | AipFast Plus Endo-Free High-Pure Rapid Plasmid Mini Kit(Centrifugal Column) |
规格: | 50T/100T/200T |
性状: | 液体 |
储存温度: | RT |
保质期: | 12个月 |
产品说明: | 收到产品后,请尽快按照试剂盒内各组分的储存温度保存! |
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