Western Blot免疫印迹简称WB，是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。WB 实验中常会出现各种问题，爱普科学专注于生产免疫组化相关产品多年，对 WB 实验有一定了解，今天跟各位同学一起分享下 WB 实验中各种问题及应用对策。

1. 电泳条带成笑脸状？

可能原因：胶不均匀冷切，中间冷却不好，电泳系统温度偏高

建议方案：减少电压减慢电泳速度，在冷室或者冰浴中进行电泳

2. 电泳条带成皱眉状？

可能原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全

建议方案：调整装置

3. 拖尾？

可能原因：样品溶解不好

建议方案：样品充分溶解混匀后上样

4. 纹理(纵向条纹)？

可能原因：样品中含有不溶性颗粒

建议方案：样品充分搅拌混匀

5. 条带偏斜？

可能原因：电极不平衡或者加样位置偏斜

建议方案：调整电极和加样

6. 条带两边扩散？

可能原因：加样量过多

建议方案：适当减少上样量

7. Marker 变黑色？

1). 可能原因：抗体和 Marker 蛋白反应

     建议方案：在 Marker 和 sample 之间空出一个孔不上样

2). 可能原因：膜封闭不够

     建议方案：延长封闭时间，选择最适宜的抗体稀释度

3). 可能原因：一抗稀释度不适宜

     建议方案：对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度

4). 可能原因：一抗孵育的温度偏高

     建议方案：建议 4℃ 结合过夜

5). 可能原因：二抗浓度度过高

     建议方案：降低二抗浓度

6). 可能原因：二抗的非特异性背景

     建议方案：增加一个二抗对照，不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否是由于二抗所致。可选择其它二抗（特异性更强的，只针  对重链）

8. 背景高？

1). 可能原因：二抗孵育时间过久

     建议方案：减少二抗孵育时间

2). 可能原因：选择膜的问题

     建议方案：硝酸纤维素的背景会比 PVDF 膜低

3). 可能原因：膜在实验过程中干过

     建议方案：实验过程中要注意保持膜的湿润

4). 可能原因：检测时曝光时间过长

     建议方案：注意曝光时间的缩短

5). 可能原因：洗膜不充分

     建议方案：增加洗膜的时间和次数

6). 可能原因：抗体和封闭蛋白有交叉反应

     建议方案：检测抗体与封闭蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入 Tween-20 可减少交叉反应

7). 可能原因：目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点，糖基化位点，乙酰化位点等），本身可以呈现多条带

     建议方案：查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白试剂大小

8). 可能原因：目的蛋白有其他剪切本

     建议方案：查阅文献或生物信息学分析可能性

9). 可能原因：样品处理过程中目的蛋白发生降解

     建议方案：裂解液中加入蛋白酶抑制剂，样品处理在冰上进行

10). 可能原因：上样量过高，太敏感

       建议方案：适当减少上样量

9. 杂带较多？

1). 可能原因：一抗不纯

     建议方案：纯化抗体

2). 可能原因：一抗特异性不高

     建议方案：重新选择或制备高特异性的抗体

3). 可能原因：二抗的非特异性结合

     建议方案：增加一个二抗对照，不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否是由于二抗所致。可选择其它二抗（特异性更强的，只针对重链）

4). 可能原因：一抗或二抗浓度偏高

     建议方案：降低抗体浓度

5). 可能原因：细胞传代较多，导致蛋白变异

     建议方案：使用原代或传代少的细胞作对照

6). 可能原因：二聚体或多聚体存在

     建议方案：增加蛋白质变性过程及强度

7). 可能原因：翻译后剪切

     建议方案：比如很多蛋白是以前体蛋白的形式合成的，在执行功能时需要进行剪切成活化的形式

10. 蛋白条带位置(大小)不对？

1). 可能原因：相对电荷

     建议方案：氨基酸电荷的组成

2). 可能原因：蛋白修饰

     建议方案：比如糖基化、磷酸化等修饰状态会导致蛋白分子量增加

3). 可能原因：胶浓度

     建议方案：不同浓度的胶跑出的蛋白条带的位置可能有所偏差

4). 可能原因：抗体孵育不充分

     建议方案：增加抗体浓度，延长孵育时间

5). 可能原因：酶失活

     建议方案：直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物

6). 可能原因：标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低

     建议方案：设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因

11. 无蛋白条带？

1). 可能原因：试剂之间不匹配

     建议方案：一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性

2). 可能原因：一抗失效

     建议方案：选择在有效期内抗体，幷选择现配现用的工作液

3). 可能原因：HRP 抑制剂

     建议方案：所用溶液和容器内避免含有叠氮化钠

4). 可能原因：抗体不能识别测试种属的相关蛋白

     建议方案：购买抗体前应认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白

5). 可能原因：二抗与一抗不匹配

     建议方案：选择针对一抗来源种属的抗体

6). 可能原因：抗体孵育不充分

     建议方案：增加抗体浓度，延长孵育时间

7). 可能原因：酶活性降低

     建议方案：直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物

8). 可能原因：洗膜过

     建议方案：洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用 0.1% 的弱去垢剂 Tween-20

9). 可能原因：标本中靶蛋白含量太低

     建议方案：增加样本上样量

12. 蛋白条带信号弱？

1). 可能原因：抗体活性降低

     建议方案：选择有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置

2). 可能原因：蛋白转移不充分

     建议方案：可以用丽春红染膜幷结合染胶（考马斯蓝）后确定条带是否转移到膜上或转移过度，适当调整转膜的时间和电流

3). 可能原因：封闭过度

     建议方案：减少封闭剂的量或缩短时间，换用不同封闭剂类型

4). 可能原因：曝光时间过短

     建议方案：延长曝光时间

5). 可能原因：HRP 抑制剂

     建议方案：所用溶液和容器内避免含有叠氮化钠

13. 背景有黑色斑点？

1). 可能原因：抗体与封闭试剂反应

     建议方案：使用前过滤封闭试剂

2). 可能原因：HRP 偶联二抗中有聚集体

     建议方案：过滤二抗试剂，去除聚集体

14. 暗背景上白色带？

1). 可能原因：HRP 含量过高

2). 建议方案：降低酶联二抗的浓度

15. 背景有不均匀的白色斑点？

1). 可能原因：转膜过程中有气泡存在

     建议方案：仔细检测，避免存在气泡

2). 可能原因：抗体分布不均匀

     建议方案：孵育抗体时使用摇床