储存温度：－20°C保存，保质期12个月。

制品说明：

1. 增强型miRNA反转录/荧光定量检测试剂盒包含miRNA检测的全部试剂。

2. 本制品采用Poly(A)加尾法，以miRNA为模板，采用特殊优化预混合miRNA RT Enzyme mix(包含Poly(A)加尾酶和反转录酶)将Poly(A)加尾和反转录一步法高效完成cDNA合成；miRNA检测使用2× miRNA qPCR Mix。适用于Total RNA或者small RNA等包含miRNA的样品。

制品特点：

● 最佳的Poly(A)加尾酶和反转录酶配比及优化的反应buffer，确保miRNA的反转录效率。

● PolyA加尾和反转录cDNA合成在同一管内一步法完成。

● 2× miRNA qPCR Mix扩增效率高，特异性强和灵敏度高。

● 配套ROX Reference Dye(100×)参比染料(货号：FP307)，可以用于各种需要高低ROX参比染料的机型。

操作步骤：

一、miRNA 3'末端进行Poly(A)加尾和逆转录反应(第一链合成)

1.      解冻2× miRNA RT Reaction Mix并混匀，miRT Enzyme Mix放于冰中备用，加入以下试剂至总体积20μL(最后加入miRNA RT Enzyme Mix)。

注意事项：miRNA RT Enzyme Mix非常粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸头外导致损失，用前请点甩离心，并且避免吸头外壁沾附损失。Enzyme Mix内酶都是过量的，即使每次按照 1.8μL使用，也不影响使用效果。

*在反应中使用的total RNA必须包含有小分子RNA(miRNA)。此过程也可以使用富集的miRNA，单纯miRNA无法直接用分光光度计定量，建议直接加入2μL~5μL。可根据目的miRNA丰度决定加入量，但是对于低丰度miRNA样品而言(如血清血浆提取物)，可直接加入最大体积8μL。

2. 移液器轻轻混匀上述配制的反应液，短暂离心后在42°C反应60 min。

3. 85°C加热5秒钟失活miRNA RT Enzyme Mix。合成的cDNA反应液可放置于-20°C保存；也可以直接进行下游PCR或者荧光定量PCR检测。

二、进行荧光定量PCR检测

Forward Primer设计原则：

1. 遵循引物设计的最普遍原则。

2. 以成熟的miRNA序列为基础，将U替换成T，这是最基础和最简单的设计方法。

3. 试剂盒中提供的Reverse primer的Tm值为65°C，设计上游引物的Tm值要尽量保证在65°C左右。

4. 若按照原则2的方式直接设计的引物其Tm值过低，可以在引物的5’端添加几个碱基(最好为G 或C 碱基)；也可以在3’端添加1个或几个A碱基(只可加A)；或者5’端和3’端同时添加。

5. 若按照原则2的方式直接设计的引物其Tm值过高，可以在引物的5’或3’端去掉几个碱基。

操作步骤：

1. 在室温融化2× miRNA qPCR Mix和Reverse primer(10μM)。

2. 使用时请将2× miRNA qPCR Mix上下颠倒轻轻均匀混合，避免起泡，并经轻微离心后使用。如果试剂没有混匀，其反应性能会有所下降。

注：请不要使用振荡器混匀。

3. 按照下表组分冰上进行反应液的配制：

注：提高特异性可选择两步法。提高扩增效率可选择三步法。

注意事项：

1. miRNA第一链cDNA的加入量不要超过Real-Time PCR体积1/10。

2. 对于特殊的检测体系中，高含量的cDNA模板易导致非特异性扩增，根据所检测miRNA的丰度适当的稀释cDNA(5-10倍或者100倍)。使用富集的miRNA做起始模板，可降低非特异扩增，提升敏感度。

3. 2× miRNA qPCR Mix不含参比染料ROX，客户并根据qPCR仪器技术指导决定是否需要加ROX参比染料，用于消除信号本底以及校正孔与孔之间产生的荧光信号误差，配套爱普科学的ROX Reference Dye(100×)参比染料(货号：FP307)。

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

5. 本制品仅供科研使用，严禁用于临床和诊断等用途。

产品说明书.pdf