HotScript First-Strand cDNA Synthesis RT-PCR Kit(TwoStep gDNA Eraser)
货号:RT316-02
品牌:爱普科学
货期:现货
价格:¥880
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产品储存:4℃运输,-20℃保存,有效期12个月。
制品说明:
本产品是一种高效、稳定、快速并可以去除基因组DNA污染的高温反转录系统。试剂盒采用分子进化技术高达60℃的全新高温反转录酶,可以通读GC含量丰富,二级结构复杂的RNA模板,极大提高反转录效率。
本试剂盒为一管式反转录预混Mix,5× HotScript RT MasterMix II中含有反转录第一链合所需的所有试剂(HotScript Hˉ RTase、RNase Inhibitor、Random Primer、Oligo(dT) Primer、dNTP Mixture、Buffer)。通常Real Time RT-PCR等实验需要先用DNase I消化去除RNA中残留的基因组DNA(gDNA),但是传统DNase I 处理复杂并容易造成RNA的降解和损失。
本试剂盒中使用了具有DNA分解活性的特殊4× gDNA Eraser Mix,2分钟快速消除gDNA残留,不需要DNase消化和后续繁琐的实验步骤。
适用范围:第一链cDNA合成。可用于高拷贝、低拷贝基因的检测,尤其GC含量高,复杂模板的高温反转录。
产品特点:
1. 新一代高温反转录酶极大提高包括复杂RNA模板的反转录效率,CT值一般提早2-3个循环。
2. 采用gDNA Eraser仅需2分钟清除DNA残留,不需要DNase消化和后续繁琐步骤。
3. 全预混的反转录Mix,只需加入RNA和水,15分钟简单快速完成反转录。
4. 同时2种Mix在-20℃不易冻结,减少了化冻和混匀时间,使用更简单便捷。
5. 本产品针对qPCR进行特别优化oligo(dT)和N6随机引物配比,使cDNA合成可从RNA转录本的各个区域起始并具有相同的反转录效率,最大程度保证了qPCR结果的真实性和可重复性。
操作步骤:(以20μL反应体系为例,也可以采用10μL反应体系)
1. 将模板RNA和5× HotScript RT MasterMix II在冰上解冻;4× gDNA Eraser Mix和RNase-free Water在室温(15-25℃)解冻,解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液轻弹或者轻微涡旋振荡混匀,可简短离心以收集残留在管壁的液体到管底。
2. 在RNase-free管里面加入以下成分:(建议使用PCR管冰上配制)
Components | Volume |
Total RNA/mRNA | ≤ 12μL* |
4× gDNA Eraser Mix | 4μL(见注意事项3) |
RNase-free Water | to 16μL(补足到总体积16μL) |
█ Total RNA不超过2μg,mRNA不超过200ng(20μL体系)
3. 移液器轻轻吹打混匀,42℃孵育2分钟(或者37℃孵育5分钟)。控温步骤均建议PCR仪器上进行。
4. 继续直接在同一管加入如下成份:
Components | Volume |
5× HotScript RT MasterMix II | 4μL(见注意事项3) |
5. 移液器轻轻吹打混匀(总体积20μL),25℃孵育10 min,50℃孵育15 min。
注意:本制品在42℃-60℃反转录均有稳定良好效果。如果模板具有复杂二级结构或高GC区域,可尝试将反应温度提高至55℃-60℃,有助于提高产量。
6. 85℃加热 5 sec 失活HotScript Hˉ RTase和gDNA Eraser。
7. 得到的cDNA产物可立即用于qPCR反应,或在-20℃保存,并在半年内使用;长期存放建议分装后在-70℃保存。cDNA应避免反复冻融。
RT-qPCR:取适量反转录cDNA产物(一般不超过qPCR反应体积的1/10)作为qPCR模板,按照厂家荧光定量PCR试剂说明书进行下一步荧光定量PCR。如果表达基因含量丰富,可以根据实际适当稀释cDNA模板使用。
注意事项:
1. 避免RNase污染。
2. 为保证反转录成功建议使用高质量的RNA样品。
3. 5× HotScript RT MasterMix II和4× gDNA Eraser Mix非常粘稠,溶液容易吸附在管壁和吸头外导致损失,用前请点甩离心后使用,并且避免吸头外壁沾附损失。5× HotScript RT MasterMix II和4× gDNA Eraser Mix内包含的酶均为过量,即使每次按照3.6μL-3.8μL使用,也不影响使用效果。
4. 可以不经过基因组去除步骤,直接用5× HotScript RT MasterMix II加RNA和水进行反转录,这样所得到的结果会与使用HotScript First-Strand cDNA Synthesis RT-PCR Kit(With SuperMix)/高温型反转录试剂盒(带预混合Mix) (货号:RT314)相当。
品牌: | 爱普科学 |
产品别名: | HotScript 高温型第一链合成反转录试剂盒(两步基因组清除) |
规格: | 100次*20uL |
性状: | 液体 |
储存温度: | -20℃ |
保质期: | 12个月 |
产品说明: | 热销爆款!带两步基因组清除! |
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